发光细菌双酶体外发光体系在快速检测中的应用研究-食品工程专业论文.docxVIP

发光细菌双酶体外发光体系在快速检测中的应用研究 摘 要 发光细菌双酶体外发光体系已经建立并且应用于 NADH 的快速检测中。本 文以鳆发光杆菌 YL 为研究对象，通过不同的酶促反应将 NADH 与其特定底物 相关联，建立了双酶发光体系快速检测乙醇和丙酮酸含量的方法，并探究了葡萄 糖及其衍生物葡萄糖-6-磷酸含量与双酶发光体系发光强度的关系。新方法能够 兼顾传统酶法检测反应条件温和、反应快速、高度专一的优点以及现场操作、快 速检测的要求，为今后开发新型便携式快速检测仪器提供了理论基础。 1、通过乙醇脱氢酶使乙醇还原 NAD+为 NADH，建立了双酶发光体系快速 检测乙醇含量的方法。通过测定 NADH 在双酶体系中的发光强度，来确定样品 中乙醇的含量。方法的线性范围为 0.002 mol/L -0.1 mol/L，检测限为 1.36×10-4 mol/L。用本法测定了其他醇类如甲醇等，其发光强度很低或反应速度明显变慢， 均不影响对乙醇的检测。应用本法测定了啤酒样品中的乙醇含量，并进行了加标 回收实验，其重复性和精密度良好。 2、通过乳酸脱氢酶使乳酸氧化 NADH 为 NAD+，建立了双酶发光体系快速 检测丙酮酸含量的方法。通过测定反应前后 NADH 在双酶体系中发光强度的差 值，来确定样品中丙酮酸的含量。方法的线性范围为 0.00014 mol/L -0.001 mol/L， 检测限为 8.537×10-5 mol/L，特异性良好。应用双酶发光体系法测定了鹌鹑血清 中的丙酮酸含量，并进行了加标回收实验，其灵敏度好，精密度高。 3、通过己糖激酶使葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，后者在葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶的催化作用下将 NADP+还原为 NADPH，通过测定 NADPH 在双酶体系中的发 光强度，来探究葡萄糖及其衍生物葡萄糖-6-磷酸含量与发光强度的关系。与紫 外分光光度计法相比，通过双酶发光体系检测葡萄糖的线性范围降低了两个数量 级，而且线性关系更好。探究了葡萄糖-6-磷酸含量与双酶发光体系发光强度的 关系，其检测限低至 6.468×10-7 mol/L。这为今后建立双酶发光体系快速检测葡 萄糖及葡萄糖-6-磷酸含量的方法奠定了基础。 III 关键词：发光细菌；双酶发光体系；乙醇；丙酮酸；葡萄糖；葡萄糖-6-磷酸； 快速检测 IV Application of coupled enzymes bioluminescent system from luminous bacteria in rapid detection Abstract Coupled enzymes bioluminescent system (CEBS) from luminous bacteria has been established and applied to rapid determination of NADH. Based on the rapid determination of NADH by CEBS and enzymatic reactions related to NADH, rapid detection methods of ethanol and pyruvic acid by CEBS from Photobacterium leiognathi YL were established. In addition, the relation between glucose or glucose-6-phosphate and their luminescence intensity in CEBS was also studied. These novel methods not only have the advantages of traditional enzymatic detection methods such as mild reaction conditions, rapid reaction velocity, and high specificity, but also meet the requirements of ready-to-use detection. This work provided theoretical basis for the development of a novel portable instrument for rapid detection in the future. A new method of ethanol rapid determination by CEBS is established based on the r