二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人结肠癌SW480细胞迁移和侵袭-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

二烯丙基二硫下调 LIMK1 抑制人结肠癌 SW480 细胞迁移与 侵袭 硕士研究生：史 玲 硕士生导师：苏 琦 教 授 中文摘要 目的：研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）对人结肠癌 SW480 细胞 LIMK1 表达和迁移与侵袭的作用以及沉默 LIMK1 的影响，观察 DADS 与 LIMK1 对 uPA/uPAR 表达的影响，探讨 DADS 抑制 SW480 细胞迁移与侵袭的分子机制。 方法：MTT 检测 DADS 对 SW480 细胞增殖的影响；RNA 干扰技术建立稳定 LIMK1-miRNA/SW480 细胞株；RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学、划痕实 验和侵袭实验分别检测 DADS 与 RNA 干扰对 SW480 细胞 LIMK1、uPA/uPAR、 迁移与侵袭及 Rac1-LIMK1 通路信号分子的影响。 结果： 1. DADS 可抑制人结肠癌 SW480 细胞增殖、迁移与侵袭 MTT 结果显示，DADS 呈时间-剂量依赖性抑制 SW480 细胞增殖(P0.05)。 迁移实验显示，48h 后，DADS 组呈浓度依赖性抑制细胞迁移率 (P0.05)。侵袭 实验显示，DADS 处理后穿膜细胞较对照组呈浓度依赖性显著减少 (P0.05)。表 明 DADS 可呈浓度依赖性抑制 SW480 细胞迁移与侵袭。 2. DADS 下调 SW480 细胞 LIMK1 表达 RT-PCR 结果显示，DADS 呈时间依赖性抑制 LIMK1 mRNA（P0.01）。免 疫细胞化学发现，未处理组 LIMK1 表达呈强阳性，DADS 处理不同时间后， LIMK1 表达明显降低（P0.05）。Western blot 显示，与对照组相比，DADS 可呈 剂量—时间依赖性下调 LIMK1 表达（P0.05）。 3. 沉默 LIMK1 对 DADS 抑制 SW480 细胞迁移与侵袭的影响 免疫荧光、Western blot、免疫细胞化学检测证明成功构建稳定沉默 LIMK1 基因的 LIMK1-miR/SW480 细胞株。Western blot 显示，DADS 组、干扰组较对 照组和空载体组的 LIMK1 及 p-LIMK1 均明显下调，LIMK1 沉默组在 DADS 处 理前后，LIMK1 表达无显著变化。表明 DADS 可抑制 LIMK1 表达及磷酸化。迁 移实验显示，48h 后，干扰组和 DADS 处理组细胞迁移率较对照组和空载体组明 显降低（P0.05），空载体组与对照组无明显变化（P0.05）。表明 LIMK1 与 SW480 细胞迁移能力正相关；DADS 通过下调 LIMK1 及磷酸化抑制 SW480 细胞迁移。 干扰组加药后细胞迁移抑制最明显，表明 DADS 还可能通过其他途径抑制细胞 迁移。侵袭实验显示，干扰组和 DADS 组穿膜细胞较未处理组和空载体组显著 减少（P0.05）；空载体组较对照组无显著改变（P0.05），表明 LIMK1 与 SW480 细胞侵袭能力呈正相关，DADS 通过下调 LIMK1 及磷酸化抑制 SW480 细胞侵袭。 干扰组加药后细胞侵袭抑制更明显，表明 DADS 还通过其他机制抑制细胞侵袭。 DADS 对 Rac1-LIMK1 信号通路的影响 RT-PCR与Western blot结果显示，DADS呈时间依赖性抑制Rac1、Rock1、 PAK1、LIMK1、Destrin mRNA和蛋白表达（P0.05）。cofilin1 mRNA和蛋白表 达无显著差异（P0.05），呈时间依赖性抑制p-LIMK1、p-cofilin1表达（P0.05）。 DADS 与沉默 LIMK1 对 uPA/uPAR 蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，DADS 处理组与 LIMK1 干扰组的 uPA、uPAR 表达 显著下调，DADS 处理干扰组后 uPA/uPAR 表达下调更明显（P0.05）。表明 DADS 可抑制 uPA/uPAR 表达，沉默 LIMK1 可负调控调控 uPA/uPAR 表达， DADS 可直接或通过下调 LIMK1 下调 uPA/uPAR 表达。 结论： 1. DADS通过负调控Rac1-LIMK1信号通路，引起LIMK1表达抑制及磷酸化受阻 抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。 2. 成功构建LIMK1-miR/SW480重组细胞系。 3. 沉默LIMK1可抑制SW480细胞迁移与侵袭。 4. DADS与LIMK1可调控uPA/uPAR表达。 5. DADS可直接或通过LIMK1间接下调uPA/uPAR抑制SW480细胞迁移与侵袭。 关键词：人结肠癌；SW480 细胞；二烯丙基二硫；迁移；侵袭；microRNA； Rac1-L