促红细胞生成素对大鼠胰腺腺泡细胞和肺组织的保护作用-临床医学(内科学)专业论文.docxVIP

促红细胞生成素对胰腺腺泡细胞和肺组织的保护作用 研究生：陈婧华（消化内科） 导 师：陈垦 教授 中文摘要 【目的】 探索原代培养胰腺腺泡细胞方法并鉴定所培养细胞的性质，为急性胰腺炎 (acute pancreatitis, AP)体外模型的构建创造条件，通过促红细胞生成素(Erythropoietin， EPO)对胰腺腺泡细胞和肺组织保护作用的研究，为今后 EPO 治疗 AP 的临床应用提 供理论依据。 【方法】 分离提纯胰腺腺泡细胞，将其置于 DMEM-F12 培养液中培养，24h 后电 子显微镜下观察胰腺腺泡细胞的超微结构变化，并运用 PaA 抗体鉴定培养细胞性质。 90 只 Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组(sham-operation group, SO)，SAP(Severe acute pancreatitis, SAP)组，EPO1000 组，EPO3000 组，EPO5000 组，每组 18 只，分 别按以下时间 24h、48h、72h 随机处死 6 只。逆行胰胆管注射 5%牛磺胆酸钠(sodium taurocholate, STC)（0.1ml/100g)制备 SAP 大鼠模型。测大鼠肺、胰腺干湿比重及体重 系数，人工碘比色法测血清 AMS，Elisa 试剂盒测 IL-1、IL-6 和 TNF-α，分析 3 种炎 性因子的相互关系；HE 染色观察胰腺和肺组织病理变化，免疫组化法检测胰腺组织 中 EPOR 的表达，Elisa 法检测 EPOR 表达水平。 【结果】 ①新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞悬浮在培养液中，形态不规则，细胞质与 细胞核比例较大。分离纯化后腺泡细胞绝大多数呈圆形或椭圆形，细胞核呈圆形，偏 于一侧，细胞间杂质较少。②24h 后可见细胞数有所增加，细胞明显聚集，2～3 天换 液后观察细胞，细胞活性好，细胞数目明显增多，传代良好。③经台盼蓝染色测定细 胞活性达 96%以上，符合进一步实验要求。④电镜下，大量的酶原颗粒位于细胞顶部 的胞质内，细胞内可见发达的粗面内质网，在酶原颗粒聚集的区域可见高尔基复合体。 ⑤经 PaA 抗体检测腺泡细胞在免疫荧光镜下呈现大片绿色荧光。⑥SAP 组大鼠肺脏干 湿比重大于 SO 组 (P0.05)，经 EPO 治疗后，肺、胰腺水肿减轻；SAP 组大鼠体重系 数亦大于 SO 组和 EPO 组(P0.05)； ⑦SAP 组与 EPO 组血清 AMS、IL-1、IL-6、TNF-α 水平均明显高于 SO 组，经 EPO 治疗 24h 和 48h 后，测血清 AMS 明显降低（P0.05）， SAP 组和 EPO 组各时间点的血清炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均高于 SO 组, SAP 组升高显著，48h 达到峰值，72h 有所回落，经 EPO 治疗后各指标均有下降，EPO 疗 效呈时间依赖性，三者之间呈正相关性(r=0.534, p=0.02; r=0.584, p=0.04; r=0.820， p=0.00)，有相互促进表达作用。⑧SO 组胰腺和肺组织均无明显病理变化；SAP 组大 鼠胰腺和肺组织出现不同程度水肿、渗出、炎症细胞浸润，部分组织出现出血、坏死、 空泡形成，细胞间结构模糊，甚至连接成片；EPO 治疗组胰腺和肺组织病理损伤程度 明显改善，病理评分显著低于 SAP 组（P0.05）。组间比较显示：除 EPO3000 和 EPO5000 间无统计学意义外，其他各组间差异均有统计学意义。⑨EPO 治疗组、假手术组大鼠 胰腺和肺组织中，可见散在的 EPOR 阳性表达，染色位置位于胞浆；不同剂量 EPO 治疗组中 EPOR 在胰腺和肺组织中均呈现大片深染的阳性表达。⑩ELISA 法测 EPOR 表达量示：假手术组、SAP 组 EPO1000 组中 EPOR 表达量的变化不显著，差异无统 计学意义，EPOR 表达量随 EPO 剂量的增加而增加。 【结论】 ①本实验方法可成功原代培养胰腺腺泡细胞，培养细胞纯度及存活率高， 符合体外实验要求；②PaA 抗体可成为鉴定胰腺腺泡细胞的一种便捷、可行的方法， 其特异性高，可推广应用于鉴定胰腺腺泡细胞；③SAP 组大鼠血清中炎症介质 IL-1、 IL-6、TNF-α 水平呈逐渐升高趋势；EPO 可有效减轻胰腺和肺组织病理损伤，降低 SAP 大鼠血清 AMS、IL-1、IL-6、TNF-α 水平；④ELISA 法及免疫组化法检测出胰腺腺泡 细胞上 EPOR 的表达，其表达量随 EPO 剂量的增加而增加，但与治疗时间无明显相 关性，由此推测 EPO 可与 EPOR 结合后，激活下游的细胞信号转导通路，从而起到 抗炎的作用。 【关键词】 腺泡细胞；原代培养；鉴定；促红细胞生成素；急性胰腺炎；保护作 用