促红细胞生成素调控心肌成纤维细胞Toll样受体4表达的效应与机制-心血管内科专业论文.docxVIP

摘 要 目的： 本文旨在探索促红细胞生成素（EPO）调控心肌成纤维细胞 toll 样受体 4 （TLR4）表达的生物学效应和机制。 方法： 用血管经张素Ⅱ（AngⅡ）预处理心肌成纤维细胞，诱导心肌成纤维细胞发 生增殖、炎症反应，再加入 EPO 干预，观察心肌成纤维细胞的增殖、炎症反应 的变化。进一步用 TLR4 过表达病毒转染心肌成纤维细胞，逆向证明 EPO 是通 过调节心肌成纤维细胞 TLR4 的表达而起到抑制 AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的 增殖和炎症反应。因此，实验分为以下 7 组，正常对照组（Control 组）：用高糖 培养基培养心肌成纤维细胞；AngⅡ组：用 10-6mol/L 的 AngⅡ干预心肌成纤维 细胞；AngⅡ+EPO 组：在 AngⅡ组的基础上加入 EPO；AngⅡ+TLR4 病毒组： 在 AngⅡ+EPO 组的基础上加 TLR4 慢病毒；AngⅡ+EPO+空病毒组：在 AngⅡ +EPO 组的基础上加空病毒；AngⅡ+EPO+LY294002 组：在 AngⅡ+EPO 组的基 础上加 PI3K 抑制剂 LY294002(10-5mol/L)；AngⅡ+EPO+Akt 抑制剂组：在 Ang Ⅱ+EPO 组的基础上加 Akt 抑制剂(10-5mol/L)。在相应组中加入相应药物干预 4d 后，用细胞计数和 CCK-8 检测各组心肌成纤维细胞的生长情况；相应组加入血 小板衍化生长因子 BB（PDGF-BB）替换 AngⅡ诱导心肌成纤维细胞迁移，应用 划痕试验检测各组细胞的迁移能力；用酶联免疫吸附实验检测各组的基质金属 蛋白酶 9（MMP9）水平；用 qRT-PCR 法和流式细胞术检测各组心肌成纤维细胞 TLR4 的表达水平来探讨 EPO 抑制心肌成纤维细胞增殖和炎症反应的机制； Western blot 检测 Akt 磷酸化蛋白的表达。 结果: CCK8 和细胞计数结果均显示，AngⅡ组心肌成纤维细胞出现了明显的增殖 反应，EPO 可以减弱 AngⅡ诱导的增殖作用，但是在 EPO 预处理的基础上加入 TLR4 过表达病毒后，心肌成纤维细胞又出现了增殖。酶联免疫吸附实验结果表 明，AngⅡ组 MMP9 水平明显升高（P0.01），相对 AngⅡ组，AngⅡ+EPO 组 MMP9 水平明显下降。在 EPO、AngⅡ的基础上加入 PI3K 抑制剂（LY294002） 或 Akt 抑制剂时，AngⅡ+EPO 组 MMP9 水平较前有所增高。划痕试验结果表明， III 与对照组相比，PDGF-BB 组心肌成纤维细胞的迁移能力明显升高，与 PDGF-BB 组相比，PDGF-BB+EPO 组迁移能力明显降低，加入 TLR4 过表达病毒后，心肌 成纤维细胞迁移能力升高。流式细胞术和 qRT-PCR 结果表明，与对照组相比， AngⅡ组 TLR4 的蛋白及 mRNA 表达水平明显增高（P0.01），AngⅡ+EPO 组 TLR4 的 蛋 白 及 mRNA 表 达 水 平 低 于 Ang Ⅱ 组 （ P0.01 ）， Ang Ⅱ +EPO+LY294002 组和 AngⅡ+EPO+Akt 抑制剂组 TLR4 的蛋白及 mRNA 表达水 平高于 AngⅡ+EPO 组和 AngⅡ+EPO+空病毒组（P0.01）。 Westernblot 结果显 示，各组间 t-Akt 表达水平无差异（P0.05）。与 AngⅡ组相比 AngⅡ+EPO 组 p-Akt 表达水平明显增高（P0.01），与 AngⅡ+EPO 组相比，AngⅡ+EPO+TLR4 病毒 组、AngⅡ+EPO+LY294002 组和 AngⅡ+EPO+Akt 抑制剂组 p-Akt 的表达水平下 降（P0.01）。 结论： EPO 是通过激活 PI3K/Akt 途径下调心肌成纤维细胞 TLR4 的表达,并依此发 挥其抗心肌纤维化的作用。 关键词：心肌纤维化；慢病毒；toll 样受体 4；促红细胞生成素；PI3K/Akt；炎 症反应；基质金属蛋白酶 9 IV Abstract Objectives: The purpose of this study is to explore the effect and mechanism of EPO regulates the expression of toll-like receptor 4 in cardiac fibroblasts. Methods: We induced proliferation and inflammation of cardiac fibroblasts by pretreatment Ang Ⅱ before EPO intervention. Transfect