儿童急性白血病的实验、临床及循证医学研究-儿科学专业论文.docx

儿童急性白血病的实验、临床及循证医学研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科 博士研究生：张耀东 博士生导师：胡群教授 中文摘要 第一部分 儿童急性白血病的实验研究 （一）儿童原代急性白血病细胞的分离及培养 目 的: 由于原代白血病细胞与体内白血病细胞的生物学性状相似,且遗传性状稳定，但原 代细胞的培养存在培养条件要求高、细胞存活率低等缺点。为此，本文就儿童原代白 血病细胞的分离及最优化的培养方法进行研究，为儿童急性白血病（AL）的体外研究 提供细胞模型。 方 法: 选取 2008 年 8 月～2009 年 9 月本院儿科收治的 25 例初诊 AL 患儿作为研究对象。 于治疗前抽取肝素抗凝的骨髓液或外周血 2~3 ml 于无菌离心管中，利用人淋巴细胞分 离液即可分离出白血病细胞。在倒置光学显微镜下观察不同时间点的原代白血病细胞 的形态变化，以及利用 CCK-8 法检测不同细胞密度、不同成分的培养液对原代白血 病细胞增殖活性的影响。 结 果: 细胞形态学观察及细胞增殖活力测定提示：原代白血病细胞在 72 h 以内存活率较 高；高密度细胞[(4～10)×106/ml]培养低于密度细胞[(1～2)×106/ml]；胎牛血清较患儿 自身的血清更有利于原代白血病细胞生长。 结 论: 利用人淋巴细胞分离液可以成功地分离出原代白血病细胞，而对于原代白血病细 胞的体外培养，选择(4～6)×106/ml 细胞密度接种于含 10%胎牛血清的培养基中生长效 果最理想。 关键词: 急性白血病；原代细胞；分离；体外培养；儿童 （二）小檗碱诱导儿童原代白血病细胞增殖、凋亡的实验研究 目 的: 探讨小檗碱诱导儿童原代白血病细胞增殖、凋亡的作用。 方 法: 取初诊的 22 例白血病患儿的骨髓或外周血 2~3 ml，用人淋巴细胞分离液分离出原 代白血病细胞。将其分为：(1)对照组；(2)25 uM 小檗碱；(3)50 uM 小檗碱；(4)100 uM 小檗碱。于 24、48、72 h 时,利用 CCK-8 法检测小檗碱对每组原代白血病细胞的生长 抑制率；同时 24 h 采用流式细胞术 PI 染色法及倒置显微镜观察不同浓度小檗碱诱导 原代白血病细胞凋亡的影响。 结 果: 不同浓度（25 、50、100 uM）的小檗碱作用于原代白血病细胞 24、48、72 h 后, CCK-8 法检测的每组细胞生长抑制率有明显差异（F =125.86,12.67 P 均＜0.01）。利用光学 显微镜观察：细胞作用 24 h 已发生典型的凋亡变化。流式细胞术 PI 染色结果提示 25、 50、100 uM 小檗碱作用原代细胞 24 h 后，其凋亡率分别为 28.51%、31.98%、48.60%。 结 论: 小檗碱具有诱导儿童原代白血病细胞凋亡并抑制细胞增殖的作用,且呈剂量、时间 依赖性。 关键词: 急性白血病；原代细胞；细胞凋亡；细胞增殖；小檗碱 （三）MDM2、P53基因表达与小檗碱对原代白血病细胞生长抑制的关系 目 的: 探讨儿童急性白血病细胞MDM2、P53基因表达及其与小檗碱对白血病原代细胞生 长抑制的关系。 方 法: 选取本院儿科收治的40例初诊AL患儿作为研究对象，利用人淋巴细胞分离液分离 出原代白血病细胞，并用CCK-8法检测不同浓度小檗碱作用原代白血病细胞24 h的细 胞生长抑制率。RT-PCR法和免疫组织化学法检测MDM2、P53在白血病细胞中的表达， 并比较MDM2、P53mRNA的表达与小檗碱对原代白血病细胞生长抑制的关系。 结 果: 儿童白血病中存在MDM2、P53的表达，其中MDM2、P53蛋白阳性率分别为66.67%、 22.78%，而MDM2、P53mRNA的表达率分别为60.71%、28.56%。不同浓度的小檗碱 对MDM2mRNA表达阳性细胞的生长抑制率明显高于MDM2mRNA表达阴性细胞（P ＜0.05），而在P53mRNA阳性表达的细胞中未发现类似结果。 结 论: 小檗碱对白血病细胞的生长抑制与MDM2mRNA的表达有关，而与P53mRNA的表 达无关。 关键词: 急性白血病；MDM2 基因；P53 基因；小檗碱 第二部分 儿童急性白血病的临床研究 儿童急性白血病细胞免疫表型与其临床分析 目 的: 由于儿童白血病细胞的抗原表达与正常造血细胞不同，常会丢失正常应有的抗原， 或表达正常不应有的抗原，甚至表达其他抗原，目前尚未发现其特异性抗原。为此， 本研究对本院 2000 年 1 月~2009 年 4 月收治的 195 例急性白血病(AL)患儿免疫分型的 资料进行分析，并与其临床特征进行比较。 方 法: 取肝素抗凝的骨髓或静脉血 2~3 ml，利用流式细胞仪进行免疫分型检测。AL 患 儿首次诱导缓解采用的治疗方案