朵丽蝶兰成花相关基因DhEFL4基因和启动子的分离与功能验证-园艺专业论文.docxVIP

独 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是受国家自然科学基金项目（编号资助，在指 导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江 农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志， 都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担 应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密, 本学位论文属于不保密。 □ （请在方框内打“√”） 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导教师亲笔签名： 日 期： 摘要 朵丽蝶兰（Doritaenopsis）由蝴蝶兰（Phalaenopsis）与朵丽兰（Doritis）杂交而 成属于广义上的蝴蝶兰，由于其花色艳丽，花期持久，因而深受消费者欢迎，市场占 有率高，具有较高的观赏价值和经济价值。 本研究通过在 Hong-Hwa Chen 建立的 OrchidBase 的 cDNA 文库中的 EST 序列 进行比对分析，筛选出两个与玉米（Zea mays）中 EFL4 同源性很高的序列，以出瓶 7 个月左右的朵丽蝶兰‘Tinny Tender’(Doritaenopsis Happy smile × Happy valentine)克 隆苗为试材，利用 RACE 技术分离基因的 cDNA 序列，并通过转基因进行功能验证。 同时利用染色体步移技术获得 DhEFL4 启动子序列。取得的主要研究结果如下： 1、利用 RACE 的方法克隆到了朵丽蝶兰中 DhEFL4 基因的 cDNA 序列，其中， 获得了 DhEFL4 基因的 cDNA 序列 593bp bp，含有一个 345 bp 的 ORF 区，编码 114 个氨基酸。 2、通过由处于光照进入黑暗时分朵丽蝶兰的根、茎、叶、花梗、花蕾及花器官 （花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱）进行实时定量 PCR，发现花蕾的表达量最高，说明 DhEFL4 和朵丽蝶兰成花相关。同时分别采集短日照和长日照处理条件下朵丽蝶兰的叶片（一 昼夜中每隔两小时采集一次），将长日照和短日照的叶片分别进行实时定量 PCR，建 立了 DhEFL4 基因的昼夜节律，结果显示 DhEFL4 基因具备明显又规律的昼夜节律性， 而且长、短日照下的表达规律不同，说明日照时间还是会影响到朵丽蝶兰的成花，即 使朵丽蝶兰是光钝感植物。 3、以 pCAMBIA1301 为植物表达载体，pMD20-T 为中间载体，构建了 PC1301- DhEFL4 正义表达载体。 4、采用蘸花法侵染拟南芥，利用潮霉素筛选纯合子并观察其表型变化，结果表 明，DhEFL4 转基因植株的开花时间有很明显的延迟，并且抽葶数增加，在 DNA 和 RNA 水平上均能检测到相应基因在转基因植株体内的表达，这一结果与拟南芥中的 报道基本一致，可推测 DhEFL4 基因也是通过光周期途径调控朵丽蝶兰成花。 5、获得 DhEFL4 ATG 前 2604bp 序列，经过 PLACE、Plant care 启动子专业软件 的分析，发现序列中包含了 TATA、CAAT、Circadian 等一系列元件。 关键词：朵丽蝶兰，DhEFL4，基因克隆，染色体步移，RT-PCR，转基因 I ABSTRACT Doritaenopsis, an intergeneric hybrid between the Phalaenopsis and Doritis,is a kind of worldwide Phalaenopsis. It’s popular in the domestic and flower market for their ornate flower shapes, and longer flowering period. Doritaenopsis has a high ornamental value and economic value . In Hong-Hwa Chen’s study, a cDNA library which named OrchidBase was established and many EST sequences were obtained. Comparative analysis showed that two sequences had