发形霞水母触手提取物的分离纯化及其活性研究-军事预防医学专业论文.docxVIP

发形霞水母触手提取物的分离纯化 及其活性研究 摘 要 随着气候变暖和近海的富营养化，全球海洋，包括我国近海水母爆发日益频繁[1]。 有毒水母伤人事件逐年上升，水母蜇伤成为最常见的海洋生物伤[2]。研究表明，水母 毒素是一类结构新颖的肽类毒素，相对分子质量从 10～600 kDa 不等。水母毒素的生 物活性广泛，包括心血管毒性、溶血毒性、神经肌肉毒性与皮肤毒性等[3]，其中心血 管毒性是水母蜇伤致死的主要原因。 近年来有很多关于水母毒素心血管毒性研究的报道，但大多数仍以粗毒为研究对 象。目前尚无水母心血管毒性蛋白成功纯化与鉴定的报道，这与水母毒素本身的特性 有关。由于水母毒素不稳定，易分解[4]，在纯化过程中活性丧失明显，严重阻碍了其 分离纯化和作用机理的研究。水母毒素心血管毒性蛋白的分离纯化已经成为水母毒素 研究的主要难点之一。 本论文以我国东海采集的代表性有毒水母——发形霞水母(Cyanea capillata, C. capillata)为研究对象，第一步研究水母触手提取物和刺丝囊毒素的制备方法，获取合 适的用于心血管毒性蛋白分离纯化的粗毒样品；第二步通过测定所选样品的毒性变 化，确定在纯化阶段各组分活性监测时的合适剂量，并分析常用缓冲液对纯化样品活 性的影响，优化纯化过程中最佳缓冲液的选择。第三步先用盐析、超滤等方式预处理 TOE，再综合利用离子交换层析、凝胶过滤层析等色谱等方法进行分离纯化，利用心 血管毒性检测模型监测各组分活性，聚丙烯凝胶电泳检测活性组分中的蛋白成分；最 后，利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术完成对分离到的 活性蛋白一级结构的测定，并对它们的序列特点及生物活性进行分析。 方 法 第一部分：触手提取物和刺丝囊毒素的制备 经过自溶、过滤、离心等步骤制备 C. capillata 的触手提取物(tentacle-only extract, TOE)和刺丝囊(nematocyst)。观察不同自溶时间对触手的自溶率和刺丝囊获得量的影 响。通过光学显微镜观察 C. capillata 刺丝囊的形态特点并进行分析。比较反复冻融、 玻璃匀浆、组织破碎仪破碎等方式破碎刺丝囊囊壁制备刺丝囊毒素（Nematocyst venom, NV）的效果。测定并比较 TOE 和 NV 两者心血管毒性和溶血活性，并通过 SDS比较两者蛋白成分差异。综合评定后确定用于后续分离纯化的粗毒样品。 第二部分：触手提取物的毒性研究 改良寇氏法测定 TOE 对昆明种小鼠尾静脉注射的 LD50：取昆明种小鼠 108 只， 雌雄各半，随机分成 9 组，每组 12 只，禁食 12 h 后按 0.1 ml/10 g 体重尾静脉注射 TOE，连续 7 d 密切观察并记录小鼠的摄食、行为、排泄物、中毒/死亡情况。 Sprague-Dawley (SD)大鼠颈外静脉插管给药，股动脉插管监测血压变化分析不同浓度 的 TOE 心血管毒性，完成 TOE 对 SD 大鼠致死临界值 Dt 的初步测定，为后续纯化组 分活性测定提供给药剂量参考。并将 TOE 浸没在常用的几种阴阳离子交换缓冲液过 夜透析，测定其对大鼠心肌细胞的致死毒性。 第三部分：TOE的分离纯化及鉴定 先用硫酸铵沉淀和超滤的方式预处理 TOE，除去大量的杂蛋白，得出可能的目 标蛋白的分子量范围，然后以 BioLogic DuoFlow (Bio-Rad 公司)和 ?KTA Purifier（GE Healthcare）蛋白纯化系统为主要技术平台，综合利用凝胶过滤、离子交换层析等多 种方法，分离纯化 C. capillata TOE 粗毒。SD 大鼠颈外静脉插管给药、股动脉插管监 测血压变化来分析各组分心血管毒性，SDS分析各组分蛋白成分，进一步指导 心血管毒性组分的分离纯化。得到目标蛋白的单一条带后利用基质辅助激光解析飞行 时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术完成对其一级结构的测定，并对它们的序列特点 及可能存在的生物活性进行初步分析。 结 果 第一部分：触手提取物和刺丝囊毒素的制备 通过自溶、过滤、离心等方式能成功分离得到 C. capillata 的触手提取物和刺丝 囊。水母触手不同的自溶时间会影响触手的溶解率。在触手自溶实验中，0 h 组是以 超声破碎的方式帮助触手自溶，2 h 组玻璃棒不间断搅拌，所以这两组未溶解的触手 的量较 4~48 h 组要少一些，同样得到的刺丝囊的量要多一些。48 h、96 h (m/v, 1:1)、 96 h (m/v, 1:2)以及 96 h (m/v, 1:3)几组未溶的触手较少。在 96 h (m/v, 1:1)获得的刺丝 囊质量最多。综上所述，发形霞水母触手自溶的最佳条件为：在触手质量与无菌海水 体积比为 1:1 的环境中自溶