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浅析猪流行性腹泻诊断的方法 　　【摘 要】 猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征。PED给养殖业带来较大损失，因此对其早期的诊断具有重大的意义，本文针对该病的诊断方法进行综述，以期为该病的防治提供一定的理论依据。 　　【关键词】 猪流行性腹泻；流行病学；诊断方法 　　猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为主要特征的传染病。多常见于寒冷冬季，本文针对PED的诊断方法进行综述，具体如下。 　　1 流行病学诊断 　　猪流行性腹泻发病多呈季节性，12月至2月多发，其他季节也可发生。该病自1971年首次在英国暴发以来，相继在比利时、德国、匈牙利、瑞士等许多欧洲国家也都暴发了PED，1978年在英国和比利时首次报道分离到该病毒株，我国于1980年首次成功分离到PEDV。1周龄哺乳仔猪受害最严重，病死率平均50%，2～4 d内可因脱水而死亡；4～5周龄的哺乳仔猪病死率不高，若母源抗体的水平不高的话，可发生轻微腹泻。成年猪可能只表现沉郁、厌食和呕吐，一般经4～5 d即可好转[1]。 　　2 临床及病理诊断 　　该病的临床症状主要是发病猪群都呈黄色水样腹泻，体温基本正常，少数病猪出现体温升高l～2℃，并带有恶臭气味的稀便等特征。剖检的病理变化主要为肠管积液，鼓起，肠系膜充血、水肿，淋巴结水肿等。病猪的组织学变化主要为空肠中后部的小肠绒毛上皮细胞脱落、绒毛变短，但在结肠，未能观察到组织病理学变化。 　　3 实验室诊断 　　3.1 病原学诊断 　　3.1.1 病毒的分离与鉴定：将采集的肠道内容物经过处理，反复冻融后，通过220 nm微孔滤膜过滤，取其毒液接种到Vero细胞上培养，通过观察细胞病变，然后结合相应的实验验证，确定该病毒是否为PEDV，但改方法耗时、费力、不容易分离出来。 　　3.1.2 免疫电镜法：免疫电镜法（IEM）可以用来判定PEDV。王继科等[2]把抗原和抗体分别经10 000 g/min离心，免疫复合物又经12 000 g/min离心，最后在电镜下直接观察到典型的病毒粒子形成的免疫复合物，建立了具有3次筛选作用的改良的IEM法，具有简便、直观、快速和定性正确等优点。由于该实验需要一定条件的实验仪器和人力，所以在养殖场推广应用有一定的难度。 　　3.2 血清学诊断 　　3.2.1 免疫荧光法：免疫荧光法（IF）一般分为直接免疫荧光法（FAT）、间接免疫荧光法（IFAT）和免疫过氧化物酶技术，3种方法都可应用于实验室诊断，但前者较为常用。 　　3.2.2 微量血清中和试验：病毒活毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物群的致病力，称之为中和试验。林志雄等[3]建立了PEDV微量中和试验，采用适应于传代细胞生长的PEDV-GI株，以PK-l5（猪肾细胞）作为指示细胞，48 h判定。研究表明该方法检验准确、可靠、具有较高的敏感性、可用于流行病学调查。 　　3.3 分子生物学诊断：分子生物学技术具有简单方便、准确性高、特异性强、敏感度高、检测速度较快等优点，已被广泛的应用于临床检测中。对于PEDV的检测，目前来说主要采用了原位杂交技术（ISH）和聚合酶链式反应（PCR）2种方法。 　　3.3.1 原位杂交技术（ISH）：原位杂交技术（In situ hybridization，ISH）是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。Okjin Kim等[4]利用标记地高辛的核酸探针，通过一系列的处理后，标记地高辛的核酸探针可以与人工感染仔猪的PEDV的核衣壳蛋白基因进行碱基互补配对，通过透射电镜下观察到仔猪的空肠和结肠的上皮细胞的胞质呈黑色。从而可以证明是PEDV感染的仔猪腹泻。 　　3.3.2 PCR技术诊断 　　 反转录多聚酶链式反应法（RT-PCR）：国外，Ishikawa等[5]根据S基因序列设计了一对可扩增目的片段854 bp的引物，成功的建立了诊断PEDV的RT-PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测。尽管此法敏感性和特异性都很好，但由于对仪器设备等要求很高，只能适合于实验室诊断，不能广泛应用于临床诊断。国内，杨群等根据设计了PEDV的M基因保守区及TGEV的S基因5′端保守区，进行了二联RT-PCR检测，实验证实具有较好的特异性和敏感性。 　　 荧光定量PCR：荧光定量PCR（Fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信