胡优敏《电生理学技术及临床应用》细胞电信号研究方法和膜片钳技术知识课件.ppt

slices Patch clamp ：cell preparation Patch clamp：DRG 背根 背根神经节 脊神经 脊髓 Patch clamp ：cell preparation 1.取材 SD大鼠称重（100-120g） 断头，取DRG 2.酶解消化 胶原酶+ 胰蛋白酶（23-25min） 中止反应后，吹散细胞 3.铺细胞 预先铺好的玻璃片上（40min）；4℃冷藏 Patch clamp-application DRG 3、微电极制备 1）玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。 玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在1.1~1.2mm。内径1mm。 电极拉制仪制备玻璃微电极  2）玻璃微电极的涂胶和抛光 一般是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。 在显微镜下将硅酮树脂(sylgard)小心地均匀涂敷于电极颈部靠尖端处，但电极尖端不能涂敷，然后用热吹风吹1～10秒，在刨光仪上使 电极尖端接近加热铂丝进行抛光处理，使微电极尖端表面变宽而光滑；同时根据电极尖端的口径的大小和实验的需要，适当掌握抛光的程度。 3）电极内液的充灌 制好的电极还需要充灌电极内液作为导电介质。使 用 前内液经过0.2μm的微孔滤膜过滤以除去杂质颗粒。一般电极充灌可分灌尖（tip　filling）和后充（back　filling）两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细管作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡。 4、高阻封接的形成　 在倒置显微镜下，操作微操纵仪，将玻璃微电极与细胞膜表面轻轻接触，形成一个较低阻抗的接触。然后给电极尖端施加负压，使玻璃电极壁与膜之间形成了紧密接触，专业术语叫做高阻封接( Gigaohm Seal)，其电阻达109Ω（GΩ）以上，从而使离子不能从玻璃电极尖端与膜之间通过，只能从膜上的离子通道进出。 要保证亿欧姆封接就必须做到： 1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅； 4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之； 5)细胞膜清洁，活性好。 膜片钳的关键在于高阻抗的封接(gigaohm seal) 5.资料分析 一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型等。 药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。 综合分析得出最后结沦． 6、单通道记录需要注意的问题 高阻封接和噪声问题是单通道记录的两个重要问题。影响高阻封接形成的因素有三个：电极尖端表面、细胞膜表面和两者接触面液体。 良好的接地和屏蔽以及较高的封接电阻是单通道低噪声记录的关键所在。 细胞分离时酶消化适度，使细胞膜表面清洁，没 有多余胶原等成分；电极制备后当时使用；细胞内液和细胞外液用时微孔过滤。  单通道记录实验中，降低噪声是保证实验成功的极其重要的一环。除了正确选择放大 器及记录设备以外，还应该从以下三方面加以考虑。　　①正确连接仪器：保证系统单点接地，消除大地环路。　　②排除外界干扰：首先应尽量避免靠近强辐射源(如马达、变压器等)。其次应采用铜丝网编织成的笼进行良好的屏蔽，显微镜、放大器探头、微操纵器等仪器置于笼中，前面开一小窗供实验者操作，其余各面封闭。　　③实验操作：细胞浴液不宜太多，电极内AgCl丝不要浸入液体太深，以免增大前级输入电容；保证电极夹持器(holder)清洁、干燥，任何溶液及灰尘的浸润都会使记录噪声增大；电极的抛光和硅酮树脂涂敷处理。　　④尽可能提高电极与细胞膜的封接电阻，在一定范围内，封接电阻越高， 则噪声越小。通常作单通道记录时封接电阻应在5GΩ以上。 全细胞记录可分为传统的全细胞膜片钳记录和穿孔膜片钳记录两种模式。 在高阻封接形成后，给电极以短暂的脉冲负压或电刺激打破电极内细胞膜，便形成全细胞式，这就是传统的全细胞膜片钳模式。通过电极尖端细胞膜的小孔可以用电极腔内液对细胞内进行透析，借此控制细胞内环境或向细胞内注射药物，这是其优点。但另一方面，全细胞记录时一个难以克服的缺陷是：某些通道电流会随时间而衰减(rundown)。这主要源于电极内液与细胞内液之间存在的快速弥散作用导致了与通道特性相关 的内源能量物质或活性物质的流失或洗脱(was