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葡萄病毒脱除技术的研究进展 　　摘 要： 葡萄是我国的一种重要果树，在长期的无性繁殖过程中受扇叶病、卷叶病、皱木复合病和斑点病等多种病毒病的危害，给葡萄的产量和品质带来了严重的影响。在生产上，无病毒的繁殖材料是控制病毒病的主要途径。总结了茎尖培养、热处理、化学处理、体细胞胚再生、电疗法和超低温脱毒等方法的脱病毒原理及在葡萄病毒脱除中的应用效果，分析了不同方法所适合脱除的病毒种类。通过对上述研究进展的综述，以期为我国葡萄病毒脱除技术研究提供参考信息。 　　关键词： 葡萄； 病毒； 脱除 　　中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪02-0304-07 　　葡萄（Vitis spp.）作为一种重要果树，在世界范围内广泛种植，但由于长期的无性繁殖，容易感染多种病毒病害。据报道，侵染葡萄的病毒种类有60种[1]，其中，分布最广、危害最重的葡萄病毒病害主要有扇叶病、卷叶病、皱木复合病和斑点病。研究表明，至少有10种病毒与葡萄卷叶病的产生有关，葡萄感染卷叶病毒后一般减产20% 左右[1-2]。皱木复合病是葡萄的一种重要的通过嫁接传染的病毒病害，其病原还不是很明确，已有研究表明，葡萄病毒A（Grapevine virus A， GVA）、葡萄病毒B（Grapevine virus B， GVB）和沙地葡萄茎痘病毒（Grapevine rupestris stem pitting- associated virus， GRSPaV）与该病害的产生有关[3-4]。该病害在葡萄指示植物上产生四种症状：Kober茎沟病，LN33茎沟病，栓皮病和沙地葡萄茎痘病[5]。据报道，葡萄感染皱木复合病后产量可减少14%～70%，嫁接成活率降低40%，生长量减少30%[6]。由于葡萄繁殖主要靠扦插和嫁接，使得病毒长期积累和重复感染，并表现为复合侵染和潜伏侵染的特征，即使是同种病毒，由于侵染的品种和发病时期不同也表现各异，因而给病毒的识别和诊断带来极大的困难。此外，病毒的侵染源复杂，传播途径广泛也进一步加大了防治的困难[7]。目前控制病毒病的主要途径就是栽培无病毒的繁殖材料，建立无病毒母本园，因此，高效的病毒脱除技术是促进葡萄无病毒产业发展的基础。综述了茎尖培养、热处理、化学处理、体细胞胚再生、电疗法和超低温脱毒等方法在葡萄病毒脱除中的应用，分析这些方法对不同葡萄品种及病毒种类的脱除效果，并揭示各个方法的病毒脱除机理，以供参考。 　　1 茎尖培养脱毒 　　很早以前人们就发现病毒粒子在植物体内的分布是不均匀的，感病植株的茎尖和根尖内不含病毒或含量很低[8-9]，研究表明在茎尖处存在一个无毒区，直径约为0.1 mm，长约为0.25 mm，此外，愈伤组织中也存在大量的健康细胞[10]，因此茎尖和愈伤组织成为获得无病毒植株的主要材料。目前关于茎尖组织不含病毒的原因有很多种观点[11]：（1）顶端分生组织分化速度快，不含维管束，病毒很难到达；（2）茎尖生长点细胞代谢比较旺盛，病毒合成受到限制；（3）茎尖处存在一个“病毒失活系统”；（4）茎尖内生长素浓度很高，可通过干扰核酸的代谢来抑制病毒的复制。随着研究的不断深入，人们发现茎尖无毒区的存在可能是由于病毒RNA在具有分生能力的茎尖细胞中被靶向降解，即发生了RNA沉默[12]。 　　早在1960s茎尖培养就被用于葡萄病毒的脱除[13]。茎尖无毒区范围很小，操作较为困难，而植株的再生能力与茎尖的大小成正比，病毒的脱除率与茎尖的大小成反比，研究表明，切取的葡萄茎尖小于0.3 mm，很难获得再生植株；而茎尖大于0.4 mm，病毒则较难脱除，所以采用茎尖培养的方法进行葡萄病毒脱除时，切取的茎尖大小一般为0.2～0.5 mm[2，14-15]。Habili等[16]利用茎尖培养的方法从24种进口的葡萄品种中脱除了多种病毒或类似病毒引起的病害，通过指示植物和dsRNA检测发现该方法脱除葡萄卷叶病的效率可达100%，同时发现该方法对茎痘、黄斑等其他症状的产生也表现出不同程度的抑制作用。不同部位茎尖的病毒脱除效果是不同的，Valero等[17]研究发现顶芽中葡萄卷叶伴随病毒-3（Grapevine leafroll-associated virus-3， GLRaV-3）的脱除率可达91%～100%，而前3个侧芽的脱除率仅为71%～87%。此外，茎尖培养的脱除率还与外植体采集时间有关，夏季材料的脱除率最高。韧皮部限制性病毒不能入侵茎尖等分生组织，所以茎尖培养的方法对这类病毒的脱除效果较好，而对于其他种类的病毒，脱除率根据葡萄的种类和病毒的分布情况而定。Gribaudo等[18]采用茎尖培养的方法处理16个葡萄品种的26份样品，通过RT-PCR检测发现GRSPaV的脱除率仅为28.9