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内生菌多粘类芽孢杆菌EJS-3产生的胞外多糖体外和体内的抗氧化活性的研究 Jun Liua,b, Jianguang Luoa, Hong Yea, Yi Suna, Zhaoxin Lua, Xiaoxiong Zenga 摘要：内生菌多粘类芽孢杆菌EJS-3产生的胞外多糖（EPS）在体外和体内的抗氧化活性由不同方法进行评价。在体外抗氧化实验中，发现原油EPS及其纯化组分（EPS-1和EPS-2）有中等的二苯基苦肼基自由基清除活性，过氧化氢清除活性，抑制脂质过氧化的效果和较强的亚铁离子螯合能力。EPS 在体外抗氧化活性下降的顺序为:原油 EPS EPS-2 EPS-1。体内的抗氧化试验方法为小鼠皮下注射D-半乳糖（D-半乳糖）6周，同时给药EPS- 1。结果，给由D-半乳糖诱导的衰老小鼠灌胃胞外多糖可以有效地提高小鼠的脾指数和肝脏指数。此外，EPS- 1给药显著增强抗氧化酶活性和总的抗氧化活性，且能使衰老小鼠的血清和肝脏中丙二醛水平均下降。这些结果表明，EPS具有潜在的抗氧化活性，可以作为新的天然抗氧化剂。 关键词：抗氧化活性 内生菌 胞外多糖 体外 体内 多粘类芽孢杆菌 1．引言 越来越多的证据表明，活性氧（ROS）和氧的衍生自由基可能诱发各种病理效应（例如，DNA损伤，致癌和 细胞变性），并引起多种疾病包括衰老，癌症，动脉粥样硬化，糖尿病，类风湿性关节炎(Finkel Holbrook, 2000; Seifried, Anderson, Fisher, Milner, 2007; Valkoet al., 2007)。因此，有必要开发和利用有效的天然抗氧化剂，使它们能够保护人体自由基，延缓许多慢性疾病的进展。在寻找新的更有效的天然抗氧化剂中，发现一些从植物、动物中得到的多糖和微生物具有强大的抗氧化活动，并将作为新的潜在的抗氧化剂进行开发(Fan et al., 2009; Lin,Wang, Chang, Inbaraj, Chen, 2009; Luo Fang, 2008; Qiao et al., 2009)。 最近，我们已报道了多粘类芽孢杆菌EJS-3的培养条件，结构特征以及该菌的胞外多糖的体外抗氧化活性（EPS），该菌是米克尔从传统中药材百部（布卢姆）的根组织中分离得到的内生菌(Liu et al., 2009, 2010; Lu et al., 2007)。我们发现，多粘类芽孢杆菌EJS-3在体外可产生一种高水平的EPS (35.26 g/L)，该EPS具有较强的超氧清除活性以及羟基自由基(Liu et al,2009)。此外，该纯化的EPS组分（EPS-1和EPS-2）已被证实是果聚糖型多糖(Liu et al,2010)。为了系统地评价多粘类芽孢杆菌EJS-3产生的EPS的抗氧化活性，在体外进行了进一步的EPS的抗氧化性研究，该研究是通过测定2,2-二苯基-1-苦基苯肼（DPPH）自由基和过氧化氢（H2O2）的清除能力，有色金属 离子（Fe2 +）的螯合活性，脂质过氧化的抑制作用和三价铁的还原抗氧化能力（FRAP）。此外，对EPS-1在体内的潜在的抗氧化活性也进行了研究，通过使用D-半乳糖（D-半乳糖）所致衰老模型鼠EPS-1是原油EPS的主要组成部分（占53.6%），该原油EPS是从多粘芽孢杆菌EJS-3得到的。 2．材料和方法 2．1 材料和试剂 原油EPS及其纯化组分EPS-1和EPS-2已在先前的报告中叙述过了。DPPH，ferrozine试剂，D-半乳糖，和2,4,6 - 三（2 - 吡啶基）-s-三嗪（TPTZ）是从Sigma化学公司（圣路易斯，密苏里州，美国）购买的。用于测定超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），过氧化氢酶（CAT），蛋白质， 丙二醛（MDA），总抗氧化能力（TAOC）的商品化试剂盒均是从南京建成生物工程研究所（中国南京）购买的。其他试剂均为分析试剂。 2．2 EPS体外抗氧化性测定 2.2.1 DPPH自由基清除活性的测定 对DPPH自由基清除活性的测定是根据Shimada, Fujikawa, Yahara, and Nakamura (1992)的方法做了某些修改进行的。简言之，是由0.2mLDPPH溶液（0.4MM DPPH甲醇）与1.0mL的样品（0.1-4.0mg/mL）和1.8mL水混合而成的。将混合物剧烈振摇并使其在室温下静置30min。然后，在517nm条件下测定该混合物的吸光度。维生素C（Vc）作为对照。DPPH自由基清除活性的计算由下列公式计算： 清除活性（%）= 其中，A0---未加样品液的吸光度； A1---加了样品溶液的吸光度； A2---空白对照的吸光度。 2.2.2 过氧化氢清除活性的测定 H2O2的