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第五章 细菌检验技术 学习目标： 掌握：革兰染色的原理、操作及结果判断；细菌接种技 术、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应的原理。 熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基和器材。 了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。 本章重点：★革兰染色的原理、操作方法及意义 ★细菌培养及生长现象 ★细菌生化反应及临床应用 第一节 细菌形态检验技术 一、染色标本镜检 （一）染色标本检查的一般程序 1. 单染色法 细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥后即可镜检 （二）常用的染色方法 （二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【方法】 （二）常用的染色方法 2. 革兰染色法 【结果】 （二）常用的染色方法 3. 抗酸染色法 【结果】 抗酸染色结果（×1000）：红色为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌 （三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （1）荚膜染色法 （三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （2）鞭毛染色法 （三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （3）芽孢染色法 （三）其他染色法 1. 特殊结构染色法 （4）异染颗粒染色法 Albert染色 奈瑟染色 （三）其他染色法 1. 负染色法 墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，×400） 第一节 细菌形态检验技术 二、不染色标本镜检 1. 压滴法 压滴法镜 检结果： 尿涂片，×400 二、不染色标本镜检 2. 悬滴法 三、其他显微镜检查 第二节 细菌接种与培养技术 红外接种灭菌器 一、基本条件 培 养 箱 生物安全柜 一、基本条件 培养基成份 培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐等 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等 基础培养基：普通琼脂平板 营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血琼脂平板、巧克力琼脂平板等 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用培养基 选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用，用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板等 增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤、GN增菌肉汤 特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基 培养基种类（按用途分） 培养基 液体培养基 培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.2％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～3％琼脂，用于细菌的分离培养。 培养基灭菌 ★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 ★ 含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌 调配—溶化—调Ph—过滤澄清—分装—灭菌—检定—保存 培养基制备程序 培养基制备程序 （一）无菌技术 细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行 无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌 细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理 标本的采集严格无菌操作 无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌 二、细菌接种与培养技术 （二）细菌接种与分离技术 灭菌接种环（针）—冷却—挑取标本（细菌）—接种—灭菌接种环（针） 平板划线法 分区划线 连续划线 分区划线法 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 连续划线法 斜面接种 半固体穿刺接种 液体接种 （三）细菌培养方法 一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌 培养温度：35℃ ～ 37 ℃ 培养时间：18～24小时 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等—培养厌氧菌 三、细菌的生长现象 菌落与菌苔 血平板上溶血现象 细菌在液体培养基中生长现象 沿穿剌线扩散生长 在穿剌线上生长 细菌在半固体培养基中的现象 一、碳水化合物的代谢试验 第三节 细菌生化鉴定技术 原理：多糖→单糖→丙酮酸→酸性产物(或产气) →pH↓ →呈酸性变色(或出现气泡) 方法： 将待检细菌以无菌操