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广东博罗地区慢性乙肝患者基因型剖析 　　【摘要】 为了探明广东博罗地区肝炎患者基因型及HBVcccDNA含量水平，利用患者血清为材料，通过利用特异性引物多重PCR方法检测HBV的B，C和D型基因型，同时通过对HBVcccDNA含量进行检测。结果表明，在61例慢性乙型肝炎病毒感染者中，HBV为B型26例(42.62%)、C型4例(6.56%)、BC混合型1例(1.64%)，未能确定基因型31例；HBVcccDNA检测阳性为33例，阳性率为54.09%，无法检测到HBVcccDNA含量的是28例。说明博罗地区HBV基因型以B型和C型多见，BC混合型较少，慢性的乙肝患者的HBVcccDNA含量检测，并不全是阳性的。 　　【关键词】 肝炎病毒 基因型 基因表达 乙肝病毒共价闭合环状DNA 　　中图分类号：R512.62 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）7-428-02 　　 　　乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性的公共卫生问题，在我国危害尤其严重。中国的乙型肝炎病毒感染者中，慢性乙型肝炎（CHB）患者约为3000万人，如不接受正确治疗可进一步发展为肝硬化、肝癌。前人的研究表明HBV基因型与病情轻重有关 [1] [2]，不同的基因型治疗的方式可能所需要的手段也不尽相同。汪莉萍等[3]研究发现，在江苏因徐州地区主要是以C型为主，C型更能引起肝脏的损伤作用，进而发生重型肝炎。肝炎病毒(HBV)是通过DNA自制进行扩增的，其乙肝病毒(HBV)cccDNA的全称是乙肝病毒共价闭合环状DNA，是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始合成模板，是乙肝病毒持续感染的关键因素，对于乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。陈明发和孙水林[4]研究认为CHB患者血清中出现cccDNA是肝脏损害的标志，可以反应病情的轻重及病情的进展，同时也反应了实时荧光定量PCR法检测CHB患者血清HBV cccDNA灵敏性较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙肝患者血清中cccDNA的水平及动态变化。HBVcccDNA含量是乙肝病毒复制最特异的指标，其灵敏性和准确性都要超过目前常用的HBVDNA检测。为了进一步探明博罗地区慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通过分子生物学来判断它们的病情轻重，我们取患者的血清进行了基因型的检测及cccDNA的定量测定工作，以期为患者的诊治提供指导。 　　1 材料与方法 　　1.1 血清标本来源，61例不同临床类型慢性乙型肝炎患者血清来自2010年2月至2011年3月博罗县人民医院感染科住院和门诊HBV感染患者(HBV DNA阳性)。其中男性49 例，女性12 例，平均年龄为49.1±17.1 岁。疾病的诊断依据参照2000年全国肝炎会议拟订的方案[5]。并排除重叠甲、丙、戊型肝炎病毒感染。 　　1.2 检测方法 　　1.2.1 HBV基因型检测 实时荧光PCR引物探针设计采用Primer Premier 5软件进行。 HBV－DNA 基因分型检测 应用实时荧光PCR法,应用南方医科大学提供的PCRbuffer和Taq酶,对已知HBV cccDNA检测阳性标本进行基因分型。①取处理液A100μl 于0. 5ml 离心管内,加待测血清100μl ,混匀,13000rpm离心10min,弃上清,加入处理液B25ul,100 ℃煮沸10分钟，13 000rpm 离心10分钟，取上清2μl 于各型基因型反应液管内,弹匀,10 000r/ min 离心10 秒，上机，预变性94 ℃ 2 分钟；循环条件: 94 ℃ 50 秒、55 ℃ 50 秒、72 ℃ 65秒,共循环40次,最后72 ℃延伸3 分钟(阴性、阳性参照同标本处理) 。结果判定按实时荧光PCR的扩增曲线进行判读。哪一型样孔呈阳性结果，则所检病毒基因为该型。 　　1.2.2 HBV cccDNA定量检测 采用广州华银生物科技有限公司的实时荧光PCR定量检测试剂盒，按照说明进行进行检测。 　　1.3 统计学处理 采用SPSS10.0软件包，比较B型、C型和B+C混合型HBV DNA水平，先行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析并进行两两比较，检验水准α=0.05。 　　2 结果与分析 　　2.1 HBV基因型检测结果 　　从表1的结果可知，在61例慢性乙型肝炎患者中男性49例( 80.33%)，女性12例( 19.67% ) 。HBV基因型检测结果表明，HBV B基因型26例(42.62％)；HBV C基因型4例(6.56)；HBV BC合型1例(1.64％)，在这三种基因型的检测范围内，未能确定基因型的是31例，占50.82%。可见在地区61患者中HBV基因型以B为主，其次C基因型，少量BC混合基因型。 　　2.2 HBVcccDNA含