RNAi技术控制害虫的机制与应用.docVIP

RNAi技术控制害虫的机制与应用 RNAi能够抑制基因特异序列的表达，为 昆虫学研宄提供了新方法，尤其是可以分析基因的功 能，控制害虫种群以及减少疾病病原体的感染。不同 种群、RNAi摄入方式、靶标基因都会影响RNAi的效 率，是转录本抑制程度存在差异的原因所在。对于不 能稳定转基因的物种，如昆虫，利用dsRNA介导的 RNAi技术便成为快速分析基因功能的重要手段。介绍 了 RNAi技术的作用机制，并从控制害虫和保护益虫方 面总结了 RNAi技术的应用。 关键词RNAi；害虫控制；dsRNA;机制；应用 S433； Q789 A文章编 号 1007-5739 (2017) 07-0144-02 RNA干扰已经彻底改变了昆虫学的研宄范围，使 研宄者能够通过抑制目的基因的表达，将改变的表型 和基因功能联系起来。对于基础研宄而言，RNAi (又 称基因沉默)为所有的昆虫基因组学研宄提供了一条 路径，同时对应用昆虫学也有巨大的潜在作用。例如， RNAi能够通过抑制关键基因提尚死亡率控制害虫。此 外，利用无害的病毒序列启动抗病毒RNAi反应，能够 有效防止益虫(如蜜蜂和家蚕)感染高致病性病毒。 1 RNAi的机制 RNAi是利用非编码小RNA分子切割靶标mRNA 抑制基因表达。主要分为以下3个阶段。 1.1起始阶段 核糖核酸酶III型家族的核酸酶Dicer，以ATP依 赖的方式逐步切割加工导入生物体的外源或内源性转 录生成的dsRNA，生成21?23nt的siRNA (small interfering RNA),其与紀标mRNA具有高度特异性， 为成功降解提供保证。 1.2效应阶段 siRNA双链结合其他蛋白复合物形成RNA诱导 沉默复合物(RNA-induced silencing complex RISC)，双 链siRNA解链，RISC介导单链反义siRNA通过碱基配 对原则从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割 靶mRNA，进一步降解mRNA，同时还可以引发宿主 细胞的一系列反应。 1.3放大效应阶段 siRNA在引导RISC切割靶RNA的同时，也在RNA 聚合酶(RdRP)的作用下以mRNA为模板合成新的 dsRNAo紧接着进入第一步循环过程，生成大量次级 siRNA,经过逐级放大效应，使mRNA彻底降解。 2 RNAi技术的应用 利用RNAi技术控制害虫和保护驯化益虫（例如蜜 蜂）已经得到广泛应用。一般情况下，RNAi序列适用 于任何形式，从单个基因型到家系，甚至昆虫所属的 目；因为目标序列可以随意操控。 2.1利用RNAi控制害虫 利用RNAi控制害虫最早是应用于玉米根虫和棉 铃虫。研究者喂养玉米根虫含有290条dsRNAs的人 工饲料，发现14个基因会使成虫的生理活动下降，并 且对液泡ATP酶亚基A基因（V-ATPase）进行了详细 的分析。人工饲料中只含有低浓度V-ATPase的dsRNAs 经玉米根虫取食后，相应的mRNA受到抑制。更重要 的是，研宄者将玉米根虫喂养在表达V-ATPase dsRNAs 的转基因玉米上后，发现根虫的V-ATPase基因表达量 下降，玉米根部受损程度降低［1］。研究者发现棉铃虫 有1个靶标基因细胞色素P450 （CYP6AE1）,该基因在 幼虫中肠中表达，对棉花的二级次生代谢产物棉子酚 具有解毒功能［2］。当将棉铃虫喂养在表达CYP6AE14 dsR-NA的转基因拟南芥和烟草上时，该基因在虫体中 肠里的表达量下降，幼虫生长发育减速［3］。同时在玉 米根虫和棉铃虫上也都有了新发现［4］。其中Snf7基因 主要参与膜受体的运输，在玉米根虫中的效果非常显 著。同时在棉花中表达半胱氨酸蛋白酶，棉铃虫取食 后，虫体围食膜功能减弱，变得更容易吸收dsRNA。 更重要的是，棉花同时表达dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋 白酶比单一表达其中一个基因的抗性强［5］。 上述研究阐明利用RNAi控制害虫有2个关键因素: ①用于RNAi靶标基因序列的选择；②传递dsRNA的 方式。其中靶标基因必须是昆虫的关键基因，同时在 昆虫的整个生活史中要持续表达。随着技术从理论证 明到应用的转变，严苛设计靶标序列是必须的。先决 条件就是从dsRNA中获得的21?25 bp siRNAs必须与 序列保证完全的一致性，同时与昆虫的mRNA具有同 源性，与非靶标物种的所有siRNAs和编码蛋白基因具 有序列差异性。在网上将候选dsRNA同时与靶标物种 的目的基因及所有公共基因组中预测的编码蛋白的基 因进行比对，杜绝不能与靶标序列完全匹配以及与非 靶标物种序列匹配的siRNAs。 RNAi成功的第2个关键就是在有效剂量下传递放 大RNAi信号。目前dsRNA合成方法已有重大突破， 一次能够合成1 kg左右，合成成本的持续