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非小细胞肺癌组织蛋白酶D表达剖析 　　[摘要]目的：探讨非小细胞肺癌(nonsmaU-ceil lung cancer，NSCLC)组织蛋白酶D(cathepsin D,Cath-D)表达与NSCLC发生、发展及浸润转移的关系。方法：肺癌组56例肿瘤组织保存蜡块，其中临床分期I期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期13例。病理分级高分化16例，中分化22例，低分化18例。另选择18例癌旁组织作对照。采用免疫组织化学染色法和原位杂交法检测Cath-D表达和mRNA水平。结果：NSCLC组Cath-D定位于癌细胞胞浆，阳性率(41/56，73.2％)显著高于癌旁组(2/18，11.1％)，淋巴转移NSCIC中的阳性率显著高于无转移NSCLC的，不同临床分期、不同病理分化程度的NSCLC Cath-D蛋白阳性表达率有显著区别。Cath-D mRNA阳性率(39/56，69.6％)显著高于癌旁组(1/18，5.6％)，不同临床分期、不同病理分化程度的NSCLC Cath-D mRNA阳性表达率有显著区别。结论：NSCLC组织中Cath-D和mRNA均有较高水平表达，Cath-D表达与NSCLC的发生、发展及浸润转移有关。 　　[关键词]非小细胞肺癌；组织蛋白酶-D；免疫组织化学；原位杂交 　　文章编号：1009-5519(2008)08-1118-03　中图分类号：R73　文献标识码：A 　　 　　肿瘤转移是恶性肿瘤患者晚期表现及患者死亡的主要原-因，近年来发现，组织蛋白酶-D(Cathepsin D，Cath-D)在恶性肿瘤侵袭和转移中起重要作用，Cath-D是一种溶酶体酸性蛋白酶，具有刺激肿瘤细胞生长、溶解细胞基底膜及细胞外基质和结缔组织的能力。本研究应用免疫组织化学染色技术和原位杂交技术检测56例非小细胞肺癌(nonsmall ceil lung cancer，NSCLC)组织中Cath-D的表达，探讨Cath-D表达在NSCLC发生、发展和预后的作用。 　　 　　1 资料与方法 　　 　　1．1 一般资料：56例病理标本取自2000年1月～2005年12月在本院胸外科手术的NSCLC患者的保存蜡块，其中男30例，女26例，年龄45～69岁，平均(57.5±6.3)岁，经病理检查证实为NSCLC。56例标本中鳞癌22例、腺癌20例、腺鳞癌8例、大细胞癌6例。高分化癌16例、中分化癌22例、低分化癌18例，临床分期I期15例、Ⅱ期28例、Ⅲ期13例，有淋巴结转移25例，无远处淋巴结转移31例。对照癌旁组18例标本选用离肿块5cm的肺组织。 　　 　　1．2 免疫组织化学染色：以上病理标本均经10％福尔马林固定，石蜡包埋5 p,m切片。兔抗人Cath-D多克隆抗体购自SantaCruz公司，工作浓度为1:200，SP试剂盒及DAB显色剂为北京中山生物公司产品，具体步骤按说明书进行，抗原修复方法为柠檬酸缓冲液(pH 6.0)95℃加热作用30min，0.01M PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：随机选择5个高倍视野进行观察，平均阳性细胞数≥10％为阳性片。 　　 　　1．3 原位杂交：石蜡切片常规脱蜡，3％H2O2：室温处理10min，新鲜配制的胃蛋白酶室温下消化5min。含DEPC的PBS缓冲液洗涤5min×3次。1％PFA/0.1M PBS(含DEPC水)室温处理10min。预杂交液37℃孵育3h。杂交液37℃孵育20h。2×SSC缓冲液洗涤5min×2次。封闭液37℃条件下作用30min。生物素化鼠抗地高辛工作液37℃孵育60min。PBS缓冲液(含DEPC)洗涤5min×3次。SABC37℃孵育30min。PBS缓冲液(含DEPC)洗涤5min×3次。生物素化过氧化物酶37℃作用20min，PBS洗涤5mi-n×3次。DAB显色。显微镜下观察，适时终止反应。梯度酒精脱水。二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定：随机选择5个高倍视野进行观察，平均阳性细胞数；≥10％为阳性片。 　　 　　1．4 统计分析：所得数据以例数或％表示，采用SPSS10.0统计学软件进行)x2分析，P＜0.05为差异有显著性。 　　 　　2 结果 　　 　　2．1 NSCLC中Cath-D免疫组化检测结果：Cath-D阳性为细胞胞浆出现棕黄色颗粒。NSCLC中Cath-D阳性表达率为73.2％(41/56)，癌旁组织为11.1％(2/18)，差异有非常显著性。NSCLC中不同病理类型Cath-D表达无显著区别，NSCLC不同临床分期Cath-D阳性表达率差异有显著性。随着肿瘤分化程度由高至低，Cath-D阳性表达明显增强，差异有显著性。有淋巴结转移的NSCLC中Cath-D表达明显高于无转移组。见表1。 　　　 　　2．2