缝隙连接细胞间通讯在“自组装”工程化软骨构建过程中的作用研究-外科学(骨科)专业论文.docxVIP

协和医院的图标 （该图片免费领取） 目 录 英文缩写词对照表…………………………………………………………1 中文摘要……………………………………………………………………. 2 Abstract……………………………………………………………………..3 前言…………………………………………………………………………5 材料和方法…………………………………………………………………6 结果…………………………………………………………………………20 附图…………………………………………………………………………24 讨论…………………………………………………………………………31 参考文献……………………………………………………………………34 致谢…………………………………………………………………….……38 附 录 （ 攻 读 学 位 期 间 发 表 论 文 目 录 ） … … … … … … … … … … … 3 9 华中科技 大学硕士学位论 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 英文缩写词对照表 GDF-5: Growth Differentiation Factor 5 CM: Chondrogenic Medium hMSCs: Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells FRAP : Fluorescence Redistribution after Photobleaching GJIC : Gap Junction-mediated Intercellular Communication GAG : Glycosaminoglycan BMP: Bone Morphogenetic Protein TGF-β: Transforming Growth Factor Beta FBS : Fetal Bovine Serum PCR: Polymerase Chain Reaction 缝隙连接细胞间通讯在“自组装”工程化软骨构建过程中的 作用研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 硕士研究生 孙志博 指 导 教 师 杨述华 教授 中文摘要 目的 探讨缝隙连接细胞间通讯在以生长分化因子 5（GDF-5）诱导的人骨 髓间充质干细胞（hMSCs）“自组装”形成软骨组织过程中的作用。 方法 体外培养 hMSCs，贴壁细胞传代，取第三代细胞，按两种培养方式 培养。一、单层培养。分为三组，每组各用软骨诱导液、含 100 ng/ml GDF-5、 2.5 μM 1-庚醇（1-heptanol）的软骨诱导液以及含 100 ng/ml GDF-5 的软骨诱导液 诱导培养三周。三周后对各组细胞进行共聚焦激光漂白恢复测定各组细胞的荧光 恢复率；免疫荧光染色检测各组细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达情况。二、“自组 装”培养。将第三代细胞按一定密度接种于 2%琼脂糖包被的 24 孔板，进行自组 装培养，形成组织团块,培养 3 周。根据软骨诱导液中刺激因子的不同分为三组： A 组仅用软骨诱导液（CM）诱导培养；B 组用含 100 ng/ml GDF-5、2.5 μM 1-heptanol 的软骨诱导液诱导培养（CM+100 ng/ml GDF-5+2.5 μM 1-heptanol）；C 组用含 100 ng/ml GDF-5 的软骨诱导液诱导培养（CM+100 ng/ml GDF-5）。对三 组的自组装组织团块进行大体观察；生物化学分别检测 1,2,3 周三组团块 GAG 的含量变化；Real-time PCR 检测组织团块缝隙连接蛋白 43（Cx43）、Ⅱ型胶原 和蛋白多糖 mRNA 的表达；HE 染色观察自组装组织细胞结构；免疫荧光、番红 O、甲苯胺蓝染色检测诱导细胞 Cx43、Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达。对免疫荧光 图像每个视野下阳性反应物的平均光密度进行测定，并对三组进行比较。 结 果 GDF-5 处 理组 的 单 层 细胞 荧 光 恢复率 为 （ 42.45% ± 2.52% ）， 1-heptanol 处理组的单层细胞荧光恢复率为（22.75 ± 1.86%），空白对照组的单层 细胞荧光恢复率为（20.18 ± 2.03%），有统计学差异（P0.05）。免疫荧光显示 GDF-5 处理组细胞表达的Ⅱ型胶原和蛋白多糖最为强烈，1-heptanol 处理组合空白对照 组Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达较弱。通过对 hMSCs 的自组装培养，形成了类似软 骨的组织团块。A 组团块的 GAG 含量在 t = 1 w 为（2.13 ± 0.40），在 t = 3 w 为 （2.65 ± 0.52）；B 组团块的