缝隙连接蛋白Cx32对依托泊苷体外抗肿瘤作用的影响及鞣花酸的增效作用-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 缝隙连接蛋白 Cx32 对依托泊苷体外抗肿瘤作用的影响 及鞣花酸的增效作用 中文摘要 目的： 1．观察由 Cx32 组成的缝隙连接(gap junction, GJ)对依托铂苷抗肿瘤作用的 影响； 2．观察鞣花酸(ellagic acid, EA)对依托泊苷(etoposide, VP-16)体外抗肿瘤作 用的影响及其可能机制。 方法： 在转染 Cx32 并通过 1 μg/ml doxycycline 诱导其稳定表达的 HeLa 细胞中， 用以下方法进行研究： 1．细胞接种免疫荧光法观察 GJ 功能增强剂(retinoid, RA)、GJ 功能抑制剂 (18-α-GA 和 oleamide)及 EA 对由 Cx32 组成缝隙连接细胞间通讯（gap junction intercellular communication, GJIC）的功能的影响。 2．“标准细胞集落形成分析法”测定 VP-16 对细胞生长的抑制作用（抗肿瘤 作用）。用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞（有条件形成 GJ）与生 长未融合细胞（无形成 GJ 的条件）。在上述有 GJ 形成和无 GJ 形成的细胞，观 察 GJ 功能和 EA 通过 GJ 功能对 VP-16 抗肿瘤作用的影响。 3．Hoechst33258 荧光染色法和 Annexin V/PI 结合双染流式细胞术分别测定 HeLa 细胞凋亡率。 4．Western blotting 法和免疫荧光法分别检测 Cx32 总蛋白和构成 GJ 功能的 胞膜蛋白 Cx32 的表达。 结果： 1. 由 Cx32 组成的缝隙连接(gap junction, GJ)对依托铂苷抗肿瘤作用的 影响 1.1 “细胞接种荧光示踪法”实验结果表明：与对照组相比，25 μM oleamide 组和 10 μM 18-α-GA 组的细胞荧光传递功能显著降低，而 10 μM RA 组的细胞荧 光传递功能增强。“标准细胞集落形成分析法”实验结果显示：在生长融合细胞 （GJ 形成），VP-16 对集落形成的抑制率为（0.42±0.02），显著高于生长未融合 细胞（无 GJ 形成，0.25±0.03）；在高密度接种细胞（生长融合，有 GJ 形成） 中， 与对照组相比，25 μM oleamide 和 10 μM 18- α-GA 可抑制 GJ 功能，且能显著 增高 VP-16 处理后的细胞集落形成率(P0.01)；而 10 μM RA 组可通过增强 GJ 功能，显著降低 VP-16 处理后的细胞集落形成率（P0.01）；但在低密度接种细 胞（生长未融合，无 GJ 形成），与对照组相比，oleamide, 18-α-GA 及 RA 对 VP-16 的集落形成抑制作用无明显影响（P0.05）。结果证明：GJ 功能可以增强 VP-16 的抗肿瘤作用。 1.2 “Hoechst33258 荧光染色法”实验结果显示，与空白组相比，30 μM VP-16 作用 HeLa 细胞 24 小时，细胞凋亡率明显增加；在生长融合细胞（GJ 形 成），VP-16 诱导细胞凋亡率为（12.13±1.34）%，显著高于生长未融合的细胞（无 GJ 形成,6.03%±0.75%）。结果证明：GJ 功能可以增强 VP-16 诱导细胞的凋亡作 用。 鞣花酸(ellagic acid, EA)对依托泊苷(etoposide, VP-16)体外抗肿瘤 作用的影响 2.1 在生长融合细胞（GJ 形成），VP-16（5μM）作用细胞 1h 后，联用 EA （8μM）作用细胞 24h，细胞集落形成率为（0.25±0.03），显著低于 VP-16 单用 组（0.42±0.02）；而在生长未融合的细胞（无 GJ 形成），EA（8μM）对 VP-16 的集落形成抑制作用无明显影响（P0.05）。结果证明：GJ 功能可以增强 EA 对 VP-16 的抗肿瘤作用。 2.2 “Annexin V/PI 结合双染流式细胞术”实验结果显示：在有 GJ 形成的 HeLa 细胞，EA（8μM）和 VP-16（30μM）联用作用于细胞 24 小时，早期凋亡 率为（12.61±0.30）%，显著高于 VP-16 单用组（8.04±0.04）%。“Hoechst33258 荧光染色法”实验结果表明：在有 GJ 形成的细胞，EA（8μM）和 VP-16（30μM） 联用作用于细胞 24 小时，其细胞晚期凋亡率为（17.04±0.56）%，显著高于 VP-16 单用组（12.13±0.30）%。结果证明：GJ 功能可以增强 EA 对 VP-16 诱导细胞的 凋亡作用。 2.3 EA（8μM）处理细胞 24 小时和 48 小时后，与对照组相比，”Western blot