钙结合蛋白S100A6在肾透明细胞癌中的表达及功能研究-外科学(泌尿外科)专业论文.docxVIP

解放军医学院博士学位论文 解放军医学院博士学位论文 万方数据 万方数据 英文缩略词表………………………………………………………………………（72） 攻读学位期间发表论文……………………………………………………………（73） 致谢…………………………………………………………………………………（74） 解放军总医院博士毕业论文 解放军总医院博士毕业论文 钙结合蛋白 S100A6 在肾透明细胞癌中的表达和作用 中文摘要 目的：在所有的泌尿系统肿瘤中，肾癌的发生率和死亡率为第二位。肾透明细胞 癌是肾细胞癌中最常见的病理类型，对放化疗不敏感，非转移肾透明细胞癌手术 切除后仍有一部分发生转移，缺乏有效的预测指标及治疗靶点。钙结合蛋白 S100A6 是 S100 蛋白家族中的一员，参与多种细胞生物学调节机制，包括细胞的 增殖、分化、周期、细胞骨架形成等。近年来越来越多研究发现 S100A6 表达水 平及其活性变化与肿瘤的发生和恶性进展密切相关，并且能够判断肿瘤的预后。 有研究发现 S100A6 在胰腺癌，结肠癌、甲状腺癌、黑色素瘤等不同类型肿瘤中 的表达升高。S100 蛋白家族在肾透明细胞癌中有报道是升高的，但在目前的研 究和报道中，没有见到 S100A6 在肾透明细胞癌中的表达及功能研究。本实验主 要研究 S100A6 在肾透明细胞癌中的表达，包括非转移和转移性肾透明细胞癌组 织和细胞株中的表达，同时结合临床病理资料与 S100A6 的 mRNA 相对表达量 通过单因素和多因素的比较进行相关性分析，在其功能学方面，我们通过构建 786-O 和 Caki-1 的肾透明细胞癌的稳转细胞株，进行了相关的体内和体外实验， 发现 S100A6 能够促进肿瘤细胞发生的增殖和侵袭，从而促进 S100A6 对肾透明 细胞癌的发生和发展。方法：①在信使 RNA 的水平以及蛋白水平和组织水平检 测 129 对非转移肾透明细胞癌组织和 58 例转移性肾透明细胞癌的表达。并采用 单因素和多因素的相关性分析以及结合术后随访资料进行生存分析，发现了 S100A6 的 mRNA 表达水平在肿瘤和转移组织表达，并且与临床病理特点结合分 析及预后的相关性；②通过 real-time PCR 和 western-blot 方法检测正常肾小管上 皮细胞株 HKC，HK-2，非转移性人肾透明细胞癌细胞株 786-O，769-P 和 Caki-2， 以及转移性人肾透明细胞癌细胞株 ACHN，Caki-1，SN12-PM6 中 S100A6 的表 达，使用第三代病毒系统稳定分别转染肾透明细胞癌细胞株 786-O 和 Caki-1，构 建 S100A6 的过表达和敲除的稳定转染细胞株，实验组和对照组的周期和增殖能 力通过 MTS 和流失细胞仪的方法检测。并通过裸鼠成瘤实验判断 S100A6 在体 内对肿瘤的影响；③通过流式细胞仪检查 S100A6 敲除和过表达对于细胞凋亡的 影响，并进行细胞的芯片检测进一步寻找 S100A6 变化后下游的差异基因；通过 划痕实验及 transwell 方法检测过表达和敲除了 S100A6 的 786-O 和 Caki-1 细胞 1 解放军医学院博士学位论文 解放军医学院博士学位论文 株的迁移和侵袭能力的变化；④分析通过 129 例肾透明细胞癌肿瘤组织中 S100A6 的信使 RNA 的表达量，对其临床病理资料进行匹配分析 S100A6 表达与 临床病理特征的相关性，并结合患者术后的随访进行生存分析，分别以死亡和转 移两个事件为结果进行分析。结果：①S100A6 的 mRNA 水平在转移性肾透明细 胞癌手术标本和细胞株中表达明显升高，在正常肾组织和细胞株中表达很低。 mRNA 水平和蛋白水平的表达方向一致，同时发现，S100A6 的 mRNA 的表达与 年龄、性别、体重指数无关，与组织学分级、临床分期和肿瘤大小相关有统计学 差异（p0.05）。②在两株肾透明细胞癌细胞系 786-O 和 Caki-1 中稳定过表达和 敲除 S100A6 后，进行 MTS 和裸鼠成瘤实验，S100A6 敲除后明显抑制肾透明细 胞癌肿瘤的增殖，体内和体外多个实验均证明 S100A6 敲除后的肿瘤细胞增殖减 慢，成瘤体积小、重量轻。在 S100A6 敲除后会影响肿瘤细胞周期调控，细胞被 阻滞在 G2/M 期。对稳转细胞进行流式细胞仪检测凋亡后发现，S100A6 敲除后 细胞发生了显著凋亡。③由于发现了 S100A6 在肾透明细胞癌中的抑制凋亡的作 用，我们进行细胞的芯片检测进行确定 S100A6 变化作引起的下游的差异靶基因 筛查，对于基因芯片的分析和预测结果显示 S100A6 与趋化因子家族，尤其是 CXCL14 关系紧密，可能就是引起细胞凋亡的因素。同时还发现 S100