P53基因突变检测方法.docxVIP

2、试剂和耗材 QIAamp?DNA Blood Mini Kit（GIAGEN，德国) Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen,11304-102） Nuclease-Free Water (Promega,P1195) d NTP Mix (Promega,P151B) PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成 DNA分子定量标准：DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物) PCR产物回收纯化试剂盒（BioSpin Gel Extraction kit，日本Bioer技术有限公司） 0.5~10 μl、2~20 μl、20~200 μl、200~1000 μl吸头（美国Axygen，公司） EP管 3、仪器 Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）； Eppendorf 5417R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国） Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter公司，美国） MVS-1型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂） 移液器2 μl、10 μl、50 μl、200 μl、1000μl（Eppendorf公司，德国） Ⅱ级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR公司，美国） X-15R高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER公司，美国） Eppendorf Mastercycter PCR仪（Eppendorf 公司德国） 电泳仪：Universal 024BR（Bio-Rad公司，美国） 电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司） 凝胶成像分析系统：Tocan 240全自动凝胶成像系统（中国） 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMAN COULTER公司，美国）20μl、200μl和1000μl加样器（吉尔森公司，法国） 旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国） 二、实验方法 1、样品采集，送检和保存 乙二胺四乙酸（EDTA）-3K抗凝管采集HIV和HBV合并感染者外周静脉血，于24 h内测定CD4+T淋巴细胞计数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80℃冻存用于P53 2、血浆样本DNA的提取 取200 μl 全血中间层于1.5ml 无菌EP管中，加入20μl蛋白酶K；再加入200μl AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56℃孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200μl无水乙醇，涡旋振荡15秒，再瞬时离心收集管壁残液；将上述混合液加入到QIAMP离心柱中，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管，注意不要让离心柱沾染废液；离心柱中加入500μl缓冲液AW1，6000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；离心柱中加入500μl 缓冲液AW2，20000g离心3分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管； 20000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，将离心柱插入1.5ml无菌EP管中，在离心柱中加入200μl 洗脱液AE（事先预热至70℃），室温孵育1分钟后，6000g离心1分钟，EP管中收集的即为目标DNA；0.7%TAE-琼脂糖凝胶电泳，验证DNA 提取质量，-20℃保存备用。 3、PCR扩增P53序列 使用引物如下： 名称 方向 核苷酸组成 Primer1 5’ cttgccacaggtctccccaa Primer2 3’外侧 aggggtcagaggcaagcaga 反应体系（50ul） 组分 体积（μl） 10×PCR 反应缓冲液 5 dNTP（2.5mM） 5 Primer1-forward (20uM ) 1 Primer2-reverse (20uM ) 1 Promega Taq (5U/μl) 0.5 DNase/RNase free water 32.5 提取的DNA 5 Total volume 50 PCR反应条件：95℃ 变性30秒，55℃退火30秒，72℃ 延伸90秒，28个循环； 4、PCR反应产物纯化 取终产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶0.5μg/ml) ，100V电泳40 min，经Ultra-Violet Product 凝胶成像后与marker比对，确认所需片段250bp，用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。 5、PCR反应产物测序 将PCR 反应产物切胶回收， 使用BECKMAN 公司的GEXP系统测序 GenomeLab CEQ/GeXP遗传分析系统测序分析实验步骤： ?? 1，配置测序PCR反应试剂： 总体积 20ul 10ul 纯水(补足至总体积) 0-9.5ul 0-3.5ul 模板 (