流式细胞方法分析淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX含量比值——一种.DOC

流式细胞方法分析淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX含量 ——一种潜在辐射生物剂量计 王治东，胡海亮，胡明，张学清，王琪，乔玉磊，刘海翔，沈丽萍，周平坤#，陈英# （军事医学科学院放射与辐射医学研究所，放射毒理与辐射危害评价研究室，北京，100850） 目的：本研究建立一种基于流式细胞分析的新方法——即采用γ-H2AX 的RL/G值（淋巴细胞中γ-H2AX含量与粒细胞中γ-H2AX的比值）代替在其他报道中采用的淋巴细胞中γ-H2AX荧光强度 方法：研究中共收集62名志愿者外周血（39名男性, 年龄范围23-56岁, 23名女性，年龄范围 24-58)用于本底水平研究。源于3名健康成人志愿者的外周血，在37℃条件下采用钴-60放射源进行0.5、1、2、4、6、8和10Gy照射，照射后在37℃条件下孵育不同时间，用于分析照射后的时间效应、剂量效应以及个体间和个体内差异研究。 结果（1）γ-射线照射增加淋巴细胞中γ-H2AX 含量，而对粒细胞没有影响。取自3名自愿者的血样经0.5、1、2、 4、 6、8和10Gy γ-射线照射后，37℃ 条件下孵育培养1、3、6、12和 24h，收集细胞，采用流式细胞方法分析外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX的水平。在照射后1、3、6、12和24小时，淋巴细胞中γ-H2AX含量呈剂量依赖性增加，而粒细胞中γ-H2AX含量没有明显改变（1）。（2）健康人群外周血γ-H2AX的RL/G值本底水平分析。为了研究γ-H2AX的RL/G值在在健康人群中的本底水平，我们对62名健康志愿者（23名女性和39名男性中国人）外周血进行分析。γ-H2AX的RL/G值介于1.01 ~1.54之间，变异系数为9.94%，平均值为1.21±0.12。23名女性志愿者与39名男性志愿者之间没有明显差别 (1.20±0.10 VS 1.22±0.15，P=0.4531)。各年龄组之间γ-H2AX的RL/G值差别不明显(21-30岁、31-40岁、41-50岁和 51-60岁组分别为1.18±0.09、1.22±0.13、1.20±0.14 和1.21±0.09，p=0.7372)。在62名志愿者中，12人有吸烟习惯。与不吸烟组相比，吸烟组的γ-H2AX的RL/G值并未明显增高 (1.21±0.12 VS 1.17±0.08，P=0.2194)。（3）照射后γ-H2AX的RL/G值的时间-效应分析。采集3名志愿者血样，分析2和10Gy照射后1、3、6、12和 24h 的γ-H2AX的RL/G值。γ-H2AX的RL/G值在照射后1小时快速升高到 2.78±0.32 (2Gy) 和5.79±0.84 (10Gy) ，这种高水平持续到照射后3h，随后开始下降。2Gy照射后12h，γ-H2AX的RL/G值 (1.81±0.14)高于未照射对照组(P=0.0133, p0.05)，照射后24小时，γ-H2AX的RL/G值(1.40±0.01)仍然高于未照射对照组 (P=0.0395, p0.05) , 但低于本底值中的最大值。10Gy照射后24h，γ-H2AX的RL/G值（2.67±0.09）仍然明显高于未照射对照组 (P=0.0006, p0.05)。（3）γ-H2AX的RL/G值分析的实验重复性和个体间差异分析。为了分析实验重复性，在三个不同时间采集三名志愿者的外周血，进行三次独立实验。血样经0-10Gy照射后培养1h，分析γ-H2AX的RL/G值。结果显示，在各个剂量照射后1小时，不同实验间差异性较小，变异系数均在10%以内。为了分析个体间的差异，三名志愿者的血样经0-10Gy照射后，分别培养1、3、6、12和 24h，分析γ-H2AX的RL/G值。结果发现，除6Gy和8Gy照射后1小时的样品（分别为18.25 和15.89）之外，所有样品的γ-H2AX的RL/G值的变异系数均小于15%。（4）剂量效应反应和曲线拟合。在选定的每一个时间点（照射后1、3、6、12、和24小时），γ-H2AX的RL/G值均以剂量依赖的方式增加。我们拟合了5个时间点（1、3、6、12和24h）的剂量效应曲线，1h：Y=0.501X+1.194，R2=0.95；3h：Y=0.798X+1.249，R2=0.913；6h：Y=0.21X+1.149，R2=0.938；12h：Y=0.174X+1.371，R2=0.953；24h：Y=0.099X+1.225，R2=0.966。在所有的剂量效应曲线中, y 为γ-H2AX的RL/G值，x为照射剂量（Gy）。 结论：1、外周血淋巴细胞γ-H2AX 的RL/G值具有相对均一的本底水平（平均值为1.21±0.12，变异系数9.94%），如果受检血样γ-H2AX 的RL/G值大于1.47（62名健康人本底值的