环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究-流行病与卫生统计学专业论文.docxVIP

暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 II 米和蔬菜为主要食物来源的 45-70 岁女性为调查对象，排除肝肾疾病及慢性代谢 性等疾病。 1.2 样本的采集、运输及保存 大米和蔬菜的采集、运输及保存 采集调查对象当季家中自种自食大米和叶类蔬菜各一份，统一编号并记录； 统一将收集的大米和新鲜蔬菜迅速送至实验室，分析前储存于-4 ℃冷库。 尿样的收集、运输及保存 收集调查对象空腹晨尿贮存于冷藏箱中，迅速送至实验室，分装至冻存管用 于相关分析；尿镉、肌酐、β2-MG 和 NAG 检测工作在样品收集后 8 h 内完成； 进行 HPLC-Q/TOF 检测的尿样储存于-80 ℃低温冰箱中。 1.3 检测指标及方法 外暴露指标 以大米和蔬菜镉含量作为外暴露指标，采用 ICP-MS 进行检测。 内暴露指标 以尿镉作为内暴露指标，采用 ICP-MS 进行检测。 肾损伤生物标志物 以尿肌酐、NAG 和 β2-MG 作为镉暴露相关的肾损伤生物标志物，采用苦味 酸法测定尿中肌酐含量，采用免疫比浊法检测尿中 β2-MG 和 NAG 的含量。 2. 尿液代谢组学分析 2.1 代谢组学分析技术平台 样本前处理 尿样室温下解冻后涡旋 2min，移取 100μL 加入配置内标溶液，充分混合后 离心 10min，移取上清液后再次离心，将二次离心获得的上清液上机分析。 液相色谱条件 采用 C18 反相色谱柱，柱温保持在 50℃，一次进样量为 5 μL；流动相 A：纯 水+0.1%甲酸，B：甲醇+0.1%甲酸，流速 0.4 mL/min，执行梯度洗脱程序。 质谱条件 电离源：ESI，毛细管电压：3500 V，干燥气温度：350 ℃，流速：10.0 L/min-1， 雾化压力：30 psi，质荷比（m/z）检测范围：50~1000。 III 2.2 代谢组学数据处理平台 采用 SPSS 13.0 进行秩和检验和 ROC 曲线绘制等；采用 MPP 12.1 进行色谱 峰的识别和前处理；运用 SIMCA-P 13.0 进行 PCA 和 OPLS-DA 分析，筛选 VIP 值较大的小分子代谢产物；通过数据库，对筛选的代谢产物进行鉴定。 3. 质量控制 现场调查人员经过统一培训，严格按照纳入排除标准选择调查对象；尿样、 大米和蔬菜在运输过程中保持冷链；各项指标检测均由实验室相关专业人员承 担，测定前调试仪器稳定性，样品进样顺序随机，样品间穿插空白样???质控样， 要求质控样中内标物丰度及保留时间 RSD 小于 10%。 结果 1. 流行病学资料 1.1 人口学资料 根据研究目的和纳入排除标准，本研究以 60 名女性为调查对象，暴露组与 对照组各 30 人，年龄分别为 55.3±6.99 岁和 59.7±7.52 岁。 1.2 调查对象外暴露水平 分析暴露组和对照组人群食用自产大米各 30 份，蔬菜各 30 份，与对照组相 比，暴露组米镉和菜镉含量增高，差异均具有统计学意义（P 0.001）。 1.3 调查对象内暴露水平 对照组和暴露组人群尿镉含量中位数分别为 1.95 μg/g.Cr 和 8.33 μg/g.Cr，分 析发现，暴露组人群尿镉含量高于对照组，差异具有统计学意义（P 0.001）。 1.4 调查对象肾损伤相关生物标志物水平 对照组与暴露组人群尿肌酐中位数分别为 84.38 mg/dL 和 85.25 mg/dL，其差 异无统计学意义（P 0.05）；对照组与暴露组人群尿 NAG 含量中位数分别为 5.50 U/g.Cr 和 6.18 U/g.Cr，其差别无统计学意义（P 0.05）；对照组与暴露组人群尿 β2-MG 含量中位数分别为 0.04 mg/g.Cr 和 0.07 mg/g.Cr，其差别无统计学意义（P 0.05）。提示与对照组人群相比，本研究中环境镉暴露组人群未见肾损害。  PAGE 6 2.代谢组学分析 2.1 检测系统的稳定性和精密度 正离子模式（ESI+）下，QC 样中内标物丰度值和保留时间的 RSD 分别为 5.13%和 0.06%，负离子模式（ESI-）下分别为 2.00 %和 0.06%。提示该检测系 统的稳定性和精密度符合代谢组学分析要求。 2.2 模式识别 通过 HPLC-Q/TOF 检测出两组人群尿液中有效代谢物共 2351 个；经非参数 检验，与对照组相比，暴露组人群尿液中有 139 个代谢物发生变化（P0.05）； 将这 139 个代谢物用于模式识别分析，建立 PCA 和 OPLS-DA 模型，发现暴露 组和对照组人群尿液呈现不同的代谢轮廓，建立的 OPLS-DA 模型能够解释两组 人群尿液中全部变异的 96.7%，模型对未知样本的判别准确率为 95.3%，说明建 立模型效果良好