课件：肿瘤侵袭转移实验技术.ppt

三、Transwell 间接观察：结晶紫法 ① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 ② 染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。 ③ 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。 四、裸鼠尾巴静脉注射 小鼠肿瘤转移模型分类： 1.人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射，在肺(尾静脉注射)、脑(颈动脉注射）肝脏(肝动脉注射）等部位观察 2.自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。 四、裸鼠尾巴静脉注射 1.裸鼠的选择：4-6周裸鼠、价格约100+rmb 2.细胞的选择：查阅文献，选择合适细胞株； 细胞浓度：具体不定，动物肿瘤一般接种2～600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤 四、裸鼠尾巴静脉注射 3.注射技巧： ①固定：50ml离心管自制或购买成品 ②注射位置：鼠尾部侧面的2条静脉，一般在尾部远端的1/3到1/2处进针。 ③注射：选择1-2ml注射器，针头采用4号或4.5号。 ④凸显静脉：温水，烤灯等 四、裸鼠尾巴静脉注射 问：如何判断已经注射进入： 注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到静脉以外，强行推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。 并且由于药液瘀阻在尾部，导致血流不畅，尾部缺血，易导致尾部炎症和坏死。 四、裸鼠尾巴静脉注射 4.观察结果： ①影像； ②大体解剖测量； ③组织切片染色 如何算一个完整的实验？ 五、总结 细胞划痕实验 transwell 裸鼠尾静脉注射 谢谢！ 首都医科大学 2015.11 肿瘤侵袭、转移实验技术 首都医科大学 2015.11 目录 一、概述 二、细胞划痕实验 三、Transwell 四、裸鼠尾静脉注射实验 五、总结 一、概述 肿瘤侵袭和转移 体外 体内 细胞划痕实验 Transwell 裸鼠尾静脉注射 二、细胞划痕实验 细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。 实验优点： 1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。 2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。 3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。 4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。 二、细胞划痕实验 实验材料： 细胞样品 仪器、耗材：6孔板 marker笔 直尺 枪头 试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS 二、细胞划痕实验 1.所有能灭菌的器械都要灭菌 2.超净工作台 紫外线消毒30min 注：需要灭菌的器材包括——离心管、吸管筒、移液枪、枪头等 二、细胞划痕实验 4.每孔加入5X105个细胞并培养约24h 注：1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底 （3. 6孔板背面画线5-6条） 二、细胞划痕实验 5.用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致 注：.人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷 二、细胞划痕实验 6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。 注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞 二、细胞划痕实验 7.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，（6），12，24小时取样，拍照。 8.计算、比较、分析 ①image J 软件计算每个视野的划痕面积 ②/en/ 二、细胞划痕实验 新：德国IBIDI（易必迪）技术 1.准备细胞，培养液，culture Insert。 2.将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。 3.细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500μm宽度的划痕。 4.每隔4-6小时拍照记录。 5.根据收集图片数据分析实验结果 二、细胞划痕实验 谈几点问题： 1.细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系 a.本身有迁移能力，且较强。 b.有极性，方便测量，观察。 c.对无血清有较强的忍受力。 2.观察的时间：一般为0、6、12、24h a.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强 b.时间太久，细胞繁殖，假阳性 二、细胞划