第六章 分子生学研究法下 ppt课件.ppt

content 1、简述原位杂交技术的原理及实验流程 2、简述酵母双杂交技术的原理及实验流程 3、简述RNAi技术的原理及实验流程 4、列举至少三种研究DNA与蛋白质相互作用 和蛋白质与蛋白质相互作用的方法 content GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白。 content content 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 content content 免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可 能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入 反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合 物沉淀到试管的底部或微膜上。 content content D.细胞内蛋白质相互作用研究 ——荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； 给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 content content E. RNAi（RNA干涉）技术及其应用 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。 content 这些小的双链RNA称为siRNA （Small /short interfering RNA ，siRNA） 。 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。 content 发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在ＲＮＡ干扰现象 siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。 content content content content 四、基因芯片及数据分析 content 基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列 （DNA microarray）技术是能同时监测大量靶 基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录 本的变化规律。 该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。 content 在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 content 基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定 基因组序列分析与待检基因探针序列的确定 检测样品 的制备 探针阵列的准备 检测设备的研制 杂交检测与数据分析 content 基因芯片技术的主要特点： 技术操作简单 自动化程高 序列数量大 检测效率高 应用范围广 成本相对低 content content 五、利用酵母鉴定 靶基因功能 content 六、其他分子生物学技术 content 凝胶阻滞实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA） 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质 相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 content 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。 content 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移