实验五肝细胞中核是酸的分离和测定.pptVIP

一、目的与要求 1、学习从动物肝细胞中提取和分离核酸的原理 2、掌握利用紫外/可见光分光光度计测定核酸的方法 二、原理 1、 依据离心原理，从肝细胞中提取出细胞核沉淀溶于蔗糖-氯化钙盐溶液中抽提，得核酸粗制品。再用三氯乙酸及有机溶剂抽提，除去小分子物质和脂类，最后用0.3mol/L高氯酸提取，获得较纯的核酸物质，可进行测定。 为防止核酸大分子的变性降解，在提纯过程中必需在0~4℃的条件下操作。 2、利用脱氧核糖颜色反应特性，通过分光光度计比色法计算DNA含量。 三、试剂与器材 1、试剂 1）细胞提取液 2）0.1mol/LTris-HCl缓冲液（PH7.4) 3）蔗糖-氯化钙盐溶液等（见指导书） 2、材料：新鲜猪肝 3、器材：离心机、水浴锅、解剖剪与镊子等 4、主要的仪器 1）研钵 2）玻璃匀浆器 3）离心机 4）分光光度计 5）酸碱度计 6) 台秤 7）水浴锅 操作流程 1．细胞破碎 2．收集核沉淀 3．核酸的分离 4．DNA的定量测定 1）标准曲线 2）核中DNA含量的测定 5. 计算 　单位：每g肝鲜重含DNA mg 1、细胞破碎 1）称取5克新鲜猪肝—绞碎肝—用冰细胞提 取液少许洗涤2次—加2ml冰细胞提取液匀浆 —做一组织涂片镜检，观察细胞是否破碎 2、收集细胞核沉淀 1）在肝糜中添加6ml冰细胞提取液制成肝匀浆液 2）离心： （1）离心：离心管盛8ml肝匀浆液，配平。 离心10 min,700r/min （2）离心：弃去上清液，将沉淀悬于8ml 冰0.1mol/LTris-HCl缓冲液中，配平。 离心10 min,700r/min。获细胞核沉淀 3、核酸的分离 （1）离心3：核沉淀加入2ml冰蔗糖-氯化钙盐溶液，制备悬液，配平。 离心10 min,（1500r/min） （2）离心4：弃去上清液，核沉淀加5ml冰 三氯乙酸，充分搅匀，配平。 离心5 min,（2000r/min） （3）离心5：弃去上清液，核沉淀加5ml冰 三氯乙酸，充分搅匀，配平。 离心5 min,（2000r/min） （4）水浴（目的？） 取沉淀加5ml95%乙醇摇匀，置于60度-70度水浴锅中水浴10 min. 离心6：配平。 离心5 min,（2000r/min） 取沉淀加5ml95%乙醇摇匀 离心7：配平。 离心5 min,（2000r/min） （5）收集核酸 取沉淀加5ml0.3mol/L高氯酸液，转入试管内，置于90度水浴30 min，注意搅拌。 取出，转入离心管中，配平。离心8：配平。 离心5 min,（2000r/min） 取出收集上清液，弃去沉淀。而获得核酸 1）、DNA 标准曲线制作 试管 项目 1 2 3 4 5 6 7 DNA 0.15mg/ml 0 0.1 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 蒸馏水ml 2.0 1.9 1.8 1.5 1.0 0.5 0 二苯胺ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀后，置于沸水浴中显色15 min,，用波长600nm比色检测吸光值，绘标准曲线 2） DNA 含量的测定 试管 项目 1 2 样品液ml 0.0 2.0 蒸馏水ml 2.0 0.0 二苯胺ml 2.0 2.0 混匀后，置于沸水浴中显色15 min,，用波长600nm比色检测吸光值，查标准曲线计算DNA含量，要求重复2次