veg慢f-c在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响.pptxVIP

VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响 田小飞 陕西省肿瘤医院妇瘤中心 研究背景 宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。 WHO报道：全世界发病人数为45万，我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。 淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预后的重要因素。 （曹泽毅主编，中华妇产科学，2004 ） 肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其复杂的过程。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现，淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又一热点，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善患者的预后。 目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在VEGF-C特异性与受体VEGFR-3 结合，诱导淋巴管生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。 血管内皮生长因子-C (vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的VEGF家族的新成员，是特异性淋巴管生长因子。在近50％的人类恶性肿瘤中表达。 VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，主要表达于正常组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及人的肿瘤细胞。 （M.A.A Al-Rawi.et al. Histology and Histopathology 2005） ( Marc G.Achen et al. Cancer Cell. 2005. ) 研究设想 VEGF-C 淋巴内 皮细胞 肿瘤细胞 肿瘤 淋巴 转移 实验方法 体外培养Hela细胞 脂质体介导寡核苷酸转染 24h、48h、72h 荧光定量RT-PCR 检测VEGF-CmRNA MTT法检测细胞生长 间接免疫荧光染色和流式 细胞术检测VEGF-C蛋白 黏附实验 Tanswell小室侵袭实验 材料 1．细胞株 人宫颈癌细胞株Hela由四川大学华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。 2．主要试剂及其配制 兔抗人VEGF-C多克隆抗体（北京中山金桥生物有限公司） 标记FITC羊抗兔二抗（北京中山生物技术有限公司） Matrigel(美国Collaborative Research公司) ECM胶（extracellular matrix）E1270 (美国Sigma公司) 纤维粘连蛋白FN（Roche公司） VEGF-C寡核苷酸：（由北京赛百盛生物技术公司合成） 反义链5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’， 　 两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸251～271，在5’端标记 FAM， 　 正义链5’-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3’， 　 两端各3个碱基进行硫代修饰。 阳离子脂质体 Lipofectamine™2000（美国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠） Transwell小室（3428型，孔径8um，美国Corning-Costar公司） 引物：VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司合成，其氨基酸序列及其产物长度如下： 基因名称 核苷酸序列 产物长度 VEGF-C 上游引物 5’-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-3 93bp 下游引物 5’-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3’ Taqman探针 5’ -FAM TGCCTCTCTCTCAAGGCCCCA - TAMRA -3’ GAPDH 上游引物 5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’ 141bp 下游引物 5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’ Taqman探针 5’-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3 实验仪器 FTC2000 荧光定量基因扩增仪 MSE Micro-Centaur Centrifuge 微型台式离心机 水平电泳仪（美国BIO-RAD公司） Gel Doc 1000凝胶成像系统 微量移液器（法国Gilson公司） Elite Esp型流式细胞仪 VEGF-C反义寡核苷酸的设计 反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书馆的GENEBANK数据库中，查找到人VEGF-C的基因序列（NM 005429）。 根据设计原则：长度在15～20bp、修饰；G+C的比例：40%－60%；避免4个碱基以上自身反向互补序列；避免4G堆积；避免六个以上的回文结构等。 设计反义链： 5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’；正义链：5’-GCT AAG GAA AGG A