免疫共沉淀试验流程及注意事项.PDF

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 免疫共沉淀实验流程及注意事项 相关服务 ：免疫共沉淀检测 （CO-IP ） 免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的 经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀实验的操作步骤比较多 ，要 得到一个完美的实验结果 ，不仅需要高质量的抗体 ，对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。在免疫共沉淀的实 验过程中 ，从蛋白样品处理、抗体-琼脂糖珠复合物洗涤到最后的鉴定 ，每步都非常关键 ，需要严格控制实验流程 中每个关键步骤的质量 ，才能达到最终的实验目的。 免疫共沉淀实验流程 该免疫共沉淀操作步骤是将抗体先结合到蛋白A/G琼脂糖珠上 ，然后再与抗原混合。相对其他方法 ，最终的得率 较低 ，但避免了抗体共洗脱的问题。如果希望获得高纯度的目的蛋白 ，而不考虑非特异性结合 ，可以将抗体和蛋白 样品在加入蛋白A/G琼脂糖珠之前进行混合 ，这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来 ，从而可能会对蛋白 质印迹法 （western blot ）检测造成干扰。 操作步骤 1. 用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次 ，最后一次吸干磷酸缓冲液 ； 7 2 6 2. 加入预冷的 RIPA Buffer（1 ml/10 个细胞、10 cm培养皿或 150 cm 培养瓶 ，0.5 ml/5×10 个细胞、6cm 2 培养皿、75cm 培养瓶 ）; 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离 ，把悬液转移到干净的 1.5ml EP管中。并置于低速摇床 ， 4℃缓慢晃动 15min （EP管插冰上 ，置水平摇床上 ）； 4. 4℃ ，14000rpm离心 15min ，立即将上清转移到一个新的离心管中 ； 5. 将 ProteinA/G琼脂糖珠用磷酸缓冲盐溶液洗两遍 ，用磷酸缓冲盐溶液配制成 50%的 ProteinA/G琼脂糖 珠工作液 ，建议减掉枪尖部分 ，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 ； 6. 在样品中以每 1ml中加 100μl的比例 ，加入 50%的 ProteinA/G琼脂糖珠工作液。水平摇床4℃摇动 10min （EP管插冰上 ，置水平摇床上 ），该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白 ； Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 7. 4℃ ，14000rpm离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中 ，去除 ProteinA/G琼脂糖珠 ； 8. 做蛋白标准曲线 （Bradford 法 ），测定蛋白浓度 ，测前将总蛋白至少稀释 1 ：10倍以上 ，以减少细胞裂 解液中去垢剂的影响 （定量 ，分装后 ，可以在-20℃保存一个月 ）； 9. 用磷酸缓冲液将总蛋白稀释到 1μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果觉得你的目的蛋白的浓度低了 ， 可以将总蛋白浓度提高到 10μg/μl （假设浓度足够 ）; 10.加入一定体积的抗体到 500μl总蛋白中 ，抗体的稀释比例因与它有作用的蛋白在不同细胞系中的多少而异 ； 11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h ；激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2h室温孵育 ； 12.加入 100μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物 ，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1h ，如