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底物浓度对酶促反应速度的影响 实验目的 1 了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2 学习测定米氏常数的原理和方法。 米氏常数Km的测定 实验时选择不同的[S],测定相对应的υ。求出两者的倒数,以1/υ对1/[S]作图,则得到一个斜率为Km/V的直线。将直线外推与横轴相交,其横轴截矩为:-1/[S]=1/ Km,由此求出Km值。该法比较简便。 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例,采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。 胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸(L-精氨酸和L-赖氨酸)的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基酸,故可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。 甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是两性离子,故不能用酸、碱滴定其含量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟甲基和二羟甲基氨基酸,使上述平衡向右移动,促使氨基酸分子上的一NH3十基解离释放出 H+,从而使溶液酸性增加,就可以酚酞作指示剂用 NaOH来滴定。 小知识点: 酚酞是碱性指示剂(变色范围是碱性),酸滴碱时用碱性指示剂;反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红。 三、器材 锥形瓶 滴定管 移液管 水浴锅 量筒等 四、试剂与材料 1. 酪蛋白 2. 胰蛋白酶 3. 甲醛 4. 酚酞 5. 氢氧化钠 充分混合后,随即取出10 mL反应混合物(作为零时的样品)吹至一含甲醛的锥形瓶中。用0.1 mol/LNaOH溶液滴定,直至混合物呈微粉红色,记下所用0.1 mol/LNaOH溶液的mL数。 【注意事项】 1.实验表明,反应速度只在最初一段时间内保持恒定,随着反应时间的延长,酶促反应速度逐渐下降。原因有多种,如底物浓度降低,产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行,酶在一定pH及温度下部分失活等。因此,研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 2.本实验是一个定量测定方法,为获得准确的实验结果,应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释,保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确,并严格控制准确的酶促反应时间。 【实验结果】 1.测定并计算酶促反应速度。 2.用实验所得的反应速度,对相应的底物浓度作图。 【实验报告】 总结实验结果,并回答如下问题: 1. 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2. 在什么条件下,测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段,为什么? 3. 米氏方程中的Km值有何实际应用? College of Life Sciences Central Laboratory of Biology * * 实验原理 1913年,Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式,即米氏方程。υ=V×[S] / ( Km+[S] )式中: υ为反应初速度 V为最大反应速度 [S]为底物浓度 Km为米氏常数 Km值是酶的一个特征性常数,可近似表示酶与底物的亲和力。 Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。 Lineweaver–Burk的作图法 — 双倒数作图法。 1 Km 1 1 ??? = ?? ? ??? + ?? V Vmax [S] Vmax 取米氏方程式的倒数形式: 1/Vmax 斜率=Km/Vmax -1/Km 五、操作 分别向6个小锥形瓶中加入5 mL甲醛溶液和1滴酚酞,并滴加0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液,直至混合物呈微粉红色。注意:每个锥形瓶中的颜色应一致。 取100 mL酪蛋白溶液,加入另一锥形瓶中,在37℃水浴中保温10分钟。将胰蛋白酶也在37 ℃水浴中保温10分钟。然后精确量取10 mL酶液加到酪蛋白溶液中(同时计时)。 在2、4、6、8和10分钟时,分别取出10 mL消化样品,准确照上法操作。注意:在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图,测定初速度。 配制不同浓度的酪蛋白溶液(7.5、10、15、20、30 g/L)测定不同底物浓度时的活力。 用实验测得的结果,以以1/υ对1/[S]作图,求出V和Km的数值。
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