补体参是与的反应.pptVIP

补体参与的反应 补体的溶血反应---- 免疫血清的制备与应用㈢ 补体结合试验 T细胞及其功能检测 E花环形成试验 淋巴细胞转化试验：形态学方法 3H—TDR掺入法 MTT比色法 T细胞亚群检测：间接免疫荧光法 免疫组化法------SABC－AP法 思考题 材料：绵羊红细胞、补体、免疫血清（自制） 问题：请设计实验检验你所制备的免疫血清的特异性？ 1. E花环形成试验 原理 人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（E受体） ，可结合SRBC形成花环样细胞团。 因为T细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的亲和力不同，所以T细胞可以形成不同类型的E花环，如EtRFC （总花环） 、 EaRFC （活性花环）、 EsRFC （稳定性花环）等。 实验器材 肝素抗凝血、绵羊红细胞（SRBC） 淋巴细胞分层液、Hank’s液、1640培养液、0.5％戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液 试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等 实验步骤 ⑴密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：取稀释好的人外周血，用滴管贴管壁（倾斜30°）轻轻叠加于2ml分离液上（界面要清晰） 配平后2000rpm离心 10mins。 离心后分为5层，由上8而下分别为：稀释的血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。 ⑵ 洗涤细胞：另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→→2000rpm离心5mins。弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml，重复离心一次。 2. 弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液0.1ml与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合→→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。 3. 取出试管，500rpm离心5mins。（注意此步非常关键，转速一定要慢）室温静置3-5分钟。 4. 取出试管，吸去半量上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加1滴戊二醛，轻轻混匀静置5mins。 5. 取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。 6. 显微镜下观察。 高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。 2. 淋巴细胞转化试验 原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。 淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。 常用方法 形态学方法 3H-TDR掺入法 MTT比色法 胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无 成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性； 淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1-2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡； 其他细胞：中性粒细胞在培养72小时后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 淋巴细胞转化率 3H-TDR掺入法 ----淋巴细胞转化试验 T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR），可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。 MTT比色法  ----淋巴细胞转化试验 MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。 细胞上的CD分子＋相应鼠抗人单克隆抗体→→→兔抗鼠IgG荧光抗体→→反复洗涤，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞。 间接SABC-AP法 SABC：链霉亲合素—生物素复合物 AP：碱性磷酸酶 生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它们的活性；链霉亲合素同一定浓度的生物素、酶混合后，就能形