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重叠延伸PCR。(OE-PCR)这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除。其基本原理如图1所示。 首先设计两PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率。OE-PCR不足之处在于：一个突变需要两对引物，3次PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；由于DNA二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合，导致目的产物得率很低；当利用Taq聚合酶进行PCR反应时，经常在PCR产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生 非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR进行了改进。1997年，URBAN等提出一步重叠延伸PCR法，使得三个PCR反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR反应即可得到含突变的目的基因。1997年，WARRENS等J利用不对称PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年，HORTON等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。利用该方法实现定点突变的实例很多.MUKHOPADHYAY用该方法将’BAMH1限制性内切酶基因的第54位半胱氨酸用丙氨酸取代后提高了该酶的活性。 运用： 第一轮PCR 反应 第二轮PCR 反应 利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23 基因 柑桔是世界上栽培最广泛、经济意义最重要的果树之一. 柑桔衰退病是全球柑桔生产中破坏最强、经 济意义最为重要的病害之一[ 1 ] . 它是由一种正义单链RNA 病毒, 属于长线病毒科( CTV) 长线病毒引起的。 主要通过蚜虫和嫁接传播, 危害以酸橙作砧木的大多数柑桔品种以及影响嫁接在 其它砧木上的柚类、葡萄柚和部分甜橙的正常生长, 主要表现为速衰、茎陷、苗黄等症状. 通过转基因柑橘表达23 KD 蛋白阻止病毒的正常侵染过程, 从而达到抗病的目的, 并证 实P23 蛋白在CTV 致病过程中发挥着重要的作用[ 9 ] . 本实验通过重叠延伸PCR 法突变掉P23 保守序列 第206 位一个碱基, 由于氨基酸序列发生改变, 可能造成相应的蛋白结构发生改变. P23 作为RNA 沉默 抑制因子, 可以利用P23 序列设计RNA 干扰载体, 进行抗CTV 研究. Ozgur Batuman 等利用RNA 干扰 原理, 将CTV 基因组中的ORF12 加上3pU TR (p23U) 构建反向重复序列, 转化烟草, 转基因植物产生 病毒RNA 序列再折叠成dsRNA 结构, 并对含有P23U 序列的GVA 病毒载体的浸染具有较高的抵抗 性[ 10 ] . 因此利用突变成后的SacI 位点, 酶切构建RNA 干扰载体, 有利于进一步的利用RNA 干扰原理 进行抗CTV 研究. 第一次PCR : 以P231/ P23R 为引物, 以P23 为模板, 产物编号为①; 第二次PCR : 以P23F/ P232 为引 物, 以P23 为模板, 产物编号为②; 第三次PCR : 以P231/ P232 为引物, ①、②为模板, 产物为突变产物. 利用重叠延伸PCR 技术进行DNA 的人工合成 1 重叠延伸PCR 技术的原理 重叠延伸PCR 技术是根据目的基因的核苷酸序列, 将目 的基因分成70~ 90 bp 不等的多条引物, 分段进行合成, 利用 相连片段间20~ 30 bp 重叠的核苷酸部分互相搭桥、互为模 板, 通过几轮连续的PCR 反应将各个片段组合成为目的 基因。 目前已有多家公司推出了高保真DNA 聚合酶与高保真 扩增试剂盒, 如TLI DNA Polymerase(Promege 公司); KOD DNA Polynerase、KOD Plus(Toyobo 公司); PyrobestTM DNA Polymerase (Takara 公司)等, 这些新型聚合酶的使用, 极大地提高了重叠 延伸PCR 反应的效率与准确性。 利用重叠延伸PCR 技术扩增长片段DNA 获得基因的全长片段是进行基因功能研究的 首要一步, 如果无法获得基因的全长片段,