生物化学实验报告材料：Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白.doc

实用标准文案 PAGE 精彩文档 实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白 一、实验目的 利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。 二、 实验原理 黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate +?O2??a Flavonol + succinate + CO2?+ H2O。 本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn ?酶切位点，去掉终止密码并引入BamH ?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 × His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E. coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。 Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。 本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中应用广泛。 三、 操作步骤 3.1 样品的制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 材料与试剂： 重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E. coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50μg/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS上样缓冲液。 仪器与设备： 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加样器（10 μL、200 μL、1 mL）、离心管（1.5 mL、10 mL）。 操作步骤： ①含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E. coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37℃培养16 h。 ②挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃过夜培养，即为种子液。 ③按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培养OD600至0.5（约2.5 h）。 ④加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 μL），置于25℃连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液5 mL于10 mL离心管中，置于冰水混合物上备用。 ⑤诱导完毕后，各样品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（5 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。 ⑥各管分别加入400 μL PBS重悬细胞，加入100 μL 5 X SDS上样缓冲液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。 注意事项： ①重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。 ②在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。 ③选择合适的表面活性剂和还