流式细胞术哈的原理与应用.pptVIP

流式细胞术原理和应用 王秀莉 2011.9.30 * 一 简介 二 构造及工作原理 三 FCM的数据分析 FCM的应用 实例 一 简 介 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 流式细胞仪的特点 单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒 举例：细胞周期分布检测 流路 (液流系统） 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路（光学系统） 光源 滤片 电路（检测系统） 光电倍增管PMT 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 （分析系统） 计算机 二 构造及工作原理 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 液流系统 流动室 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 液流系统 激光光源：目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。 光学系统 信 号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 光学系统 散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性 FS SS 光学系统 光路 （滤片特性） 光学系统 流式细胞仪光路图 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 光学系统 电路 电压调节 光电倍增管 电压 volts 增益 Gain 信号放大方式 检测系统 电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。 在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。 检测系统 常用荧光染料介绍 FITC： 绿色 525nm PE： 橙黄色 575nm ECD： 橙红色 610nm PE－CY5： 深红色 675nm PerCP： 深红色 675nm PE－CY7： 深红色 755nm 7AAD： 深红色 675nm PI(碘化丙啶）： 橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 光路补偿FITC/PE/ECD/PC5 三 FCM的数据分析 单参数一维直方图 纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。 2.