大豆蛋特白的提取与含量测定.pptVIP

大豆蛋白的提取与含量测定? 指导老师 徐文俊 序言蛋白质化学实验 蛋白质是一切生物体内重要的组成成份，蛋白质是由二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子化合物，溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。 蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间构型。在各种物理化学因素影响下，由于副价键的破裂，使其空间结构遭受不同程度的破坏，蛋白质的物理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋白质的变性。 一、大豆蛋白的提取 目的要求 1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法 2 、计算粗提产率 2、学习计算蛋白质收率 实验原理 大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。 称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。 试剂和器材 1、试剂 （1）10%Nacl （2）0.2%NaoH （3）75%乙醇 （4）6mol/L HCL （5） 1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH 2、器材 （1）离心机 （2）烧杯 （3）滴管 （4）PH试纸等 操作方法 1、水抽提 将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min， 3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。 取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。 其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和1 mol/L HCL，调PH4.5~5.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。 Folin酚法测定蛋白质含量? 目的要求 掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。 Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。 试剂和器材 1、材料： 本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。 2、试剂： （1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。 （2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。 （3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3； 称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。 3、器材： 试管10支 试管架一个 移液管：（5ml、1ml） 移液管架 洗瓶 恒温水浴 723型分光光度计 操作方法 1、标准曲线的制作： 标准酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为200μg/ml。用一支0.5ml移液管分别取上述标准酪蛋溶液0ml, 0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支试管中去，将此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至1ml。再在另一支试管中加入1ml缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入1mlFolin试剂甲并不时地进行振荡，10min后再加入后1in试剂乙的应用液4毫升。立既摇匀放入55℃水溶中保湿5min。取出后用自来水冷却1min。于波长650nm进行比色测定各管的OD值，以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，既可得到标准曲线。 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定 * * 蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定条件下（如PH，离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分子的大小及形状等