第08讲从原系核到真核基因工程.ppt

3、转基因动物的研制 3.1 外源基因的构建及制备 Structural gene Regulatory element reporter 3.1.2 调控元件的选择 (1) 内含子的调节作用 (2) 利用“看家基因”启动子实现广泛表达 ?-actin, metallothionein, histone H4 et al (1) 外源基因的组织特异性表达 (2) 外源基因表达的时空控制 3.1.1 目的基因的选择 (1) 选用目的基因的基因组片段 (2) 选用目的基因的cDNA序列 常用的主要器官组织特异性启动子 细胞类型 特异性启动子 心肌细胞 ?-myosin heavy chain 肝脏细胞 albumin 胰岛细胞 insulin 软骨细胞 Type II collagen 内皮细胞 tie-1, tie-2 表皮细胞 K5, k14 keratin 乳腺细胞 WAP, casein T 细胞 CD4, CD3 B 细胞 CD19 转录水平上调节转基因的活性 启动子 诱导物 表达特性 metallothionein Zn, Cd 在许多组织中有低水平 的基础表达，诱导后表 达水平提高100倍 hsp68 heat shock 基础表达几近于无 lac operator IPTG 细胞体外诱导 classical tet-system reverse tet-system tet or dox doxycyclin 加入tet阻断基因转录 加入dox激活基因转录 四环素类调控系统（tetracycline control system） classical tet-system reverse tet-system tTA Y Tet R VP16 promoter X tet-Operat. CMVmin without tet Tet R VP16 promoter X tet-Operat. CMVmin Y with tet Y rtTA VP16 promoter X tet-Operat. CMVmin without doxycyclin Y rtTA VP16 promoter X tet-Operat. CMVmin with doxycyclin tTA rtTA-VP16 rtTA-VP16 转录后水平上调节转基因的活性 promoter X Y ER-LBD* Y ER-LBD* HSP90 + ligand Y ER-LBD* HSP90 无功能 有功能 3.1.3 报告基因的应用 报告基因常与转基因融合以利于转基因动物的检测， 和转基因表达模式的测定。 常用报告基因包括： lac Z CAT firefly luciferase hGH green fluorescent protein (GFP) 3.2 转基因方法 3.2.1 受精卵的显微注射技术 外源基因片段的制备 DNA结构、纯度及其溶液等对转基因效率的影响 DNA的结构（线性DNA） 载体的序列（尽量删除原核序列） DNA片段的长度（?50 kb） DNA片段的浓度（1-5 ?g/ml） DNA样品的纯度（无有害物质和颗粒性杂质） 缓冲液组分（ 5-10mmol/L Tris-HCl,pH7.4-7.5, 0.1-0.25mmol/L EDTA ） 军事医学科学院生物工程研究所 发育和疾病遗传学研究室显微注射室一角 3.2.2 胚胎干细胞法 E3.5 mouse embryo Blastocyst Embryonic Stem(ES) Cell Targeting Construct Electroporate ES Cells Homologous Recombination Targeted ES Cells Microinjection Chimeras Implantation Germ-line Transmission Wild Type Knockout Phenotype Analysis ES细胞经显微注射引入受体小鼠囊胚 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的SV40 DNA分子必须经过 包装后才具有感染能力，因此插入的 外源DNA片段不能太大。为了尽量提 高SV40的装载量，必须删除一些基因 片段，因此重组的SV40分子必须与野 生型病毒共感染受体细胞，才能形成 有感染力的重组病毒颗粒。 Apr ori vi