第二章基因自工程的主要技术原理1.pptVIP

第二章 基因工程的主要技术原理 一、质粒DNA的提取 1 .碱裂解法提取质粒DNA （2） 所用的试剂作用 ④ KAc-HAc缓冲液 （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 ②引物的长度 ④引物的碱基序列 ⑤引物的碱基组成 3）避免形成引物二聚体（dimer） ⑥引物的Tm值 2、Northern blot 使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。 （7）TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR ) template template 5’ 3’ 3’ 5’ P1 P2 P3 AD P1, P2, P3为特异性引物，25bp, Tm 65℃ 左右 AD为简并引物， 15-16bp, Tm 44-45℃ 已知序列 Liu, YG and Whittier RF (1995). Genomics 25:674-681. 1、Southern blot 双链DNA 限制性内切酶 消化 电泳分离 检测 放射自显影 转膜 NaOH变性 洗膜 杂交 标记的探针 NaOH或高温变性 原理和方法: 五 .分子杂交 技术 应用: 基因拷贝数检测; 基因文库筛选, 获取目的基因; 遗传疾病诊断; 转基因样品检测, 等… 是相对于Southern blot而命名的。 利用DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理，通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 原理和方法: 单链RNA 变性胶电泳分离 检测 放射自显影 转膜 洗膜 杂交 标记的探针 NaOH或高温变性 应用: 主要用于基因在转录水平上的表达研究。 基因时空特异性表达，及表达模式分析； 候选基因表达分析，有利于排除候选 基因，等… Pi36-1 Pi36-2 RiceGAAS预测 CRG2(2) CRG3(0) CRG4(0) 5.8 kb 4.8 kb 6.4 kb a b c 物理图谱 NBS-LRR NBS-LRR RM5647(5) Northern blot的原理与Southern blot相比 有三点不同: (1)检测的对象不同. (2) 变性方法是不同的, 它不能用碱变性,因为 碱变性会导致RNA的降解. (3)探针不同. 3、 Western blot 通过抗体与靶蛋白的抗原特异性反应检测蛋白质样品。 主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。 Western blot的原理与Southern blot相比 有两点不同: (1) 检测的对象不同. (2) 探针的性质不同,在Western blot中使 用的探针是抗体(蛋白质) * * 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快； （1）原理 DNA双链 变性 DNA单链 复性 强碱 中性 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起;当K+取代Na+时,生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。 变性 利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。 当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。 当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。 当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。 碱裂解法 ① 葡萄糖 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。 ② EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ③ NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS 用于沉淀DNA。 ⑤ 乙醇 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 ⑥ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑦ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 ⑧