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序列前处理 癌症基因组解析计划 (Cancer Genome Anatomy Project , CGAP) 为研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所NCI的CGAP计划，构建了很多正常的或是癌症前期的和癌症后期的组织的cDNA文库，并进行了大规模的EST测序。CGAP网站提供了多种工具用以分析不同文库间基因表达的差异，如： ● Digital Gene Expression Displayer (DGED) ● cDNA xProfiler DNA 芯片是指将许多许多特定的DNA 寡核苷酸或DNA 片段(包括cDNA ) 固定在芯片的每个预先设置的区域内, 将待测样本标记后同芯片进行杂交, 通过杂交信息的分析来检测基因的功能和基因组研究的分析系统。 ESTs 是用于制备DNA 芯片的很好基因资源。由于EST s 直接来源于cDNA , 因此EST s 文库可代表cDNA 文库用于制备DNA 芯片所需的探针库。 基因芯片或微阵列技术流程 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE) 技术, 能同时对上千个转录物进行研究，是一种用于定量及高通量基因表达分析的实验方法。 SAGE的原理： （1）一个9-14 碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。一个9 碱基顺序能够分辨262,144 个不同的转录物, 而人类基因组估计仅能编码80,000种转录物，所以理论上每一个9 碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。 （2）将短片段标签相互连接形成长的DNA 分子，对该克隆进行测序得到大量连续的单个标签，可对数以千计的mRNA 转录本进行分析。 （3）特定的序列标签的出现次数就反应了对应的基因的表达丰度。 ESTs数据的不足 谢 谢 5. ESTs与基因的差异表达 6. ESTs与DNA芯片的制备 绿色: 基因表达↓ 红色: 基因表达↑ 黄色: 基因表达相当 …. …. Clone 反转录（可选） 读取光密度 聚类分析（非同源功能注释） 标记 杂交 反转录 EST分析 …………. …………. …………. Gene Chip 0.1 0.06 0.05 0.04 … 0 0 0.07 0.01 … 表达量 矩阵 G1,G3,G5 G2,G4 G6,G9 … 利用EST，SAGE分析结果制作芯片（研究已发现的基因） 连接， 转化 原位合成 ?????????????????????????????????????????????????????????????????? 7. ESTs与基因表达系列分析 7. ESTs与基因表达系列分析 反转录 酶切 连接 测序 单条测序＝对30－40条EST测序 分析 由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析： 基因表达量分析、寻找新基因等等 实验步骤较长要求较高 SAGE技术流程 8.电子克隆 利用计算机技术，依托现有的网络资源EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等，采用生物信息学方法(包括同源性检索、聚类、序列拼装等)延伸EST序列，以期获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。 5’ 3’ est Search in est database Search in est database Search in est database Search in est database 5’ 3’ Complete cDNA 简单电子克隆模式图 ESTs很短，没有给出完整的表达序列。 低丰度表达基因不易获得。 由于只是一轮测序结果，出错率达2%-5%。 有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基因组DNA的污染。 有时出现镶嵌克隆。 序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大。 * 第七章 表达序列分析 生物信息学 表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST) 是由大规模随机挑取的cDNA 克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签 表达序列标签（EST） EST的概念 EST是指通过对cDNA 文库随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA 的5’或3’端序列，长度一般为60 ～ 500 bp. EST 是基因的“窗口”，可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，故被称之为“表达序列标记” EST 技术的形成和发展 上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序的想法就曾提出，但反对者认为cDNA序列缺少重要的基因调控区域的信息。 EST技术应用的首次报道是Adams(1991)等从三种人脑组织cDNA文库随机挑取609个克隆进行测序, 得到一组人脑组织的E