03蛋白上质化学.ppt

赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 3、分离纯化的基本方法 （1）根据溶解度不同的分离方法 ① 盐析 ② 等电点沉淀 ③ 有机溶剂分级分离 ④ 温度影响蛋白质溶解 （2）根据电荷不同的分离方法 ① 电泳 ② 离子交换层析 （3）根据相对分子质量不同的分析方法 ① 透析和超滤 ② 密度梯度（区带）离心 ③ 凝胶过滤又称分子筛层析 （4）根据对配体的特异生物学亲和力不同的分离方法 亲和层析 + + + + 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 电泳（electrophoresis） ① 定义：在外电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动。 ② 应用:电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸、核苷酸等生物分子的分离、制备和分析。 ③分类：经典的自由电泳或称移动界面电泳 区带电泳：在支持物上将混合物分离成若干区带。 支持物包括滤纸、薄膜、粉末、细丝和凝胶。最常用的支持物为聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和寡核苷酸，后者适于分离核酸。 双向电泳； 毛细管电泳 ； 等电聚焦电泳。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * SDS(SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 离子交换层析（ion-exchange column chromatography） ①定义：是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。 ②离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性高分子化合物。它是离子交换树脂的基质（matrix），带电基团通过后来的化学反应引入基质。树脂一般都制成球形颗粒。 ③分类: 阳离子交换树脂含有酸性基团，可解离出H+，当溶液中含有其他阳离子时，它们可以与H+发生交换而“结合”到树脂上； 阴离子交换树脂含有碱性基团，可解离出OH-离子，能与溶液中的其他阴离子发生交换而结合到树脂上。 ④广泛用于蛋白质和核酸大分子层析的支持介质是： 纤维素离子交换剂 交联葡聚糖离子交换剂 ⑤改变溶液中的盐离子强度和pH，可以使结合到离子交换剂的蛋白质依结合力由小到大的先后顺序被洗脱下来。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 分离氨基酸常用的是带有耐酸性非常强的磺酸根SO3－Na＋（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂。 首先将这种树脂填充到柱子中，然后注入含有样品的流动相，样品中含有阳离子成分X＋，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X＋与Na＋交换，即发生阳离子交换后，形成SO3－X＋。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂，广泛用于提取氨基酸、有机酸、抗生素等小分子生物制品。在提取过程中，生物制品从发酵液中吸附在离子交换树脂上，然后在适宜的条件下用洗脱剂将吸附物从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 蛋白质混合物的分离通过改变溶液中盐类离子强度和pH值来完成。对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。 ① 蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷的静电吸引，pH值决定离子交换剂与蛋白质的电离程度。 ② 盐类的存在降低离子交换剂的离子基团和蛋白质的相反电荷基团之间的静电吸引。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 氨基酸的离子交换层析（p134） 洗脱规律 ①用阳离子交换柱时，氨基酸一般按酸性、中性、碱性氨基酸的顺序先后被洗脱。在带电荷相同情况下，极性大的氨基酸先被洗脱下来。 ②用阴阳离子交换柱时，氨基酸的洗脱顺序与阳离子交换柱相反。在带电荷相同情况下，极性大的氨基酸先被洗脱下来。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 亲和层析（affinity chromatography） 分离蛋白质的一种极有效的方法，常只需一步处理即可得到纯度较高的某种蛋白质。 它是根据不同蛋白质对其配体(ligand)分子的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的。 亲和层析的基本步骤是：先把提纯的某种蛋白质的配体连接到载体表面的官能团，待提纯的蛋白质则与层析柱上其特异的配体结合，其他的蛋白质不具有特异的结合位点将通过柱子而流出；被特异地结合在柱子上的蛋白质可用含自由配体的溶液洗脱下来 。 赵丹丹 第3章 蛋白质化学 * 赵丹丹 第3章 蛋白质化学