生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章收核酸的研究方法.pptVIP

第14章 核酸的物理化学性质 一、核酸的水解 核酸的酸水解 核酸的碱水解 RNA的碱水解 核酸的酶水解 核酸酶的分类Ⅰ 核酸酶的分类Ⅱ 二、核酸的酸碱性质 碱基的解离Ⅱ 碱基的解离Ⅲ 核苷的解离 核苷酸的解离 核酸中磷酸基的解离 核苷酸的解离曲线Ⅰ 核苷酸的解离曲线Ⅱ 小牛胸腺DNA的滴定曲线 三、核酸的紫外吸收 四种核苷酸的紫外吸收曲线 摩尔磷吸光系数 DNA的增色效应和减色效应 DNA的紫外吸收光谱 四、核酸的变性、复性及杂交 DNA变性示意图 DNA分子的熔点Tm DNA分子的热变性曲线 DNA分子的热变性曲线 影响DNA分子Tm的因素 影响DNA分子Tm的因素 GC对含量与熔点的关系 GC对含量与熔点的关系 RNA的热变性曲线 DNA的复性 不同DNA的复性曲线 核酸杂交 第15章 核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定 DNA的分离Ⅱ RNA的分离 RNA的分离方法 核酸含量的测定 二、核酸的超速离心 核酸密度的测定Ⅱ 测定DNA中G－C含量 DNA中G-C含量与密度的关系 溶液中核酸构象的研究 纯化核酸 三、核酸的凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 扁平状染料与DNA的结合 聚丙烯酰胺凝胶电泳 RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变性温度范围较宽。不管是DNA还是RNA，加入甲酰胺可降低其Tm值。双链RNA的变性曲线几乎与双链DNA相同。 1.一种浮萍的18SrRNA 2.酵母的杀伤RNA（双链）加甲酰胺 3.同2，但无甲酰胺 变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的单链重新缔合成双链DNA，这个过程称为复性（renaturation）。将热变性的单链DNA骤然冷却，DNA不能复性，只有缓慢降温才能使热变性的DNA复性，这个过程又称为退火（annealing）。 核酸杂交是以已知的异源DNA或RNA片段为探针，检测与之互补的DNA或RNA的存在。多数情况下是对探针进行标记，少数情况下标记的是被检测的DNA或RNA。 (Research methods of nucleic acid) 一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成 DNA的分离Ⅰ 真核生物细胞中的染色体DNA与碱性的组蛋白结合在一起，成为核蛋白（DNP），DNP溶于水和浓盐溶液（如1mol/L NaCl），但不溶于生理盐水（0.14mol/L NaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L，使DNP纤维沉淀出来。用玻璃棒将DNP纤维缠绕在棒上，再经多次溶解和沉淀以纯化DNP。 用水饱和的苯酚抽提，DNA溶于上层水相，变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相中。如此反复操作以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐的条件下加2倍体积的冷乙醇，将DNA沉淀出来，用乙醚或乙醇洗涤沉淀。用此方法可得到纯的DNA。 用RNase处理除去残留的RNA 。为了得到大分子的DNA，应防止核酸酶和机械力对DNA的破坏。 分离RNA时要特别注意防止RNase对RNA的降解。RNase无处不在，且耐高温，不易灭活。 制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具须经高压灭菌，不能高压灭菌的器具要用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC，RNase的不可逆抑制剂）浸泡处理，再煮沸以除净DEPC。 ②在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂（如盐酸胍）。 ③在提取和纯化RNA的试剂中加入RNase的抑制剂（如RNasin）。 目前最常用的制备RNA的方法有两个： 1．用酸性胍盐提取，然后用苯酚和氯仿多次抽提除去蛋白质。异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变性剂。此法用于小量制备RNA。 2．用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度1.33g/cm3，在最上层；DNA密度在1.71g/cm3左右，位于中间；RNA密度1.89g/cm3，沉在底部。 分离poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸亲和层析法。 紫外分光光度法 定磷法 定糖法 核酸密度的测定Ⅰ 将8.0mol/L的CsCl装入离心管中，DNA样品溶于CsCl溶液，加在离心管顶部。以45000转/分的速度离心16小时以上，此时离心管中形成线性的CsCl密度梯度，底部为1.80g/cm3，顶部为1.55g/cm3。DNA样品带停留在与之密度相应的位置。根据此位置的CsCl密度，可知DNA的密度。 也可用一已知密度的DNA与待测密度的DNA一起离心，根据两条带的位