细胞生物学实验技术(一).ppt

动物细胞生物学实验技术 主 要 内 容 第一节 培养细胞的细胞生物学 第二节 细胞培养 第三节 显微镜知识 第四节 细胞生物学实验技术 第一节培养细胞的细胞生物学 主要内容 （一）体内、外细胞的差异 体外培养的细胞和体内细胞的比较 相似：仍存在细胞和细胞、 细胞和基质的相互关系 单个细胞虽能生长繁殖, 但不如群体细胞能力强， 当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果 对细胞外基质仍有依存性 差异：失去原有组织结构和细胞形态， 分化减弱或不明显 细胞外基质 存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。 这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。 　1．影响细胞的存活、生长与死亡 　　正常真核细胞，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为定着依赖性（anchorage dependence）。例如，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。　　 2．决定细胞的形状 细胞呈单个游离状态时多呈球形。 同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附时可表现出完全不同的形状。 细胞外基质决定细胞的形状这一作用是通过其受体影响细胞骨架的组装而实现的。 3．控制细胞的分化 细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。 例如，成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。 4．参与细胞的迁移 细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。 细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基质时诱导粘着斑的形成，粘着斑是联系细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。 （一）体内、外细胞的差异 体外培养的细胞仍具有研究的意义 许多性状仍与体内相同 如体外培养的心肌细胞仍可博动， 细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭／开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 （二）体外培养细胞的分型 贴附型细胞的分类 成纤维细胞型 梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。 上皮型细胞： 游走细胞型： 散在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。 此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 培养细胞的生命周期 生命周期的三个阶段 原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养 到 第一次传代。 原代培养分为两种方法 直接接种组织块 由组织分离出细胞后接种 传代期： 衰退期： 细胞的一代生存期 1．潜伏期（Latent Phase） 1．潜伏期（Latent Phase） 不同的细胞贴壁的时间不同 如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强, 能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面 如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱, 需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱） 分离、纯化细胞 贴附过程 ：3步 贴附因子粘附 细胞开始附着 细胞进一步牢固附着—伸展 细胞贴壁影响因素 生物因素：血清、培养液中的促附着因子 机械、物理等其他因素： 流动：培养液流动可阻止细胞附着 离心：促进附着 低温：可抑制附着 加速细胞贴壁的措施 培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展 合适的培养温度 细胞铺展（伸展） (spread) 进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动 铺展的过程 细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞) 逐渐铺开伸展成为扁平的极性细，铺展的越好与生长基质的表面接触面越大 极性细胞就是细胞在体外的特征性细胞形态 铺展状况与细胞的生长有密切关系 只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行 2， 指数增生期（Logarithmic growth Phase） 2， 指数增生期（Logarithmic growth Phase） 3．停滞期（Stagnate Phase）： 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。 第二节、细胞培养 主 要