几丁质酶的活性改良及固定化研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．1．2．4酶连 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．1．2．4酶连 18 2．1．2．5大肠杆菌感受态的制备 ．18 2．1．2．6电转化 ．．19 2．1．2．7随机突变库质量检测 ．19 2．1．3 随机突变库的筛选 1 9 2．1．4 野生型和突变蛋白的诱导表达和纯化 19 2．1．5 蛋白SDS．PAGE检测 ．20 2．1．6 蛋白浓度测定 21 2．1．7 几丁质酶野生型Pachi和突变体PachiN35D酶学性质研究 22 2．1．7．1 N．乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制 22 2．1．7．2几丁质酶活测定 ．22 2．1．7．3几丁质酶野生型和突变体最适反应温度测定 ．22 2．1．7．4几丁质酶野生型和突变体最适pH测定 ．．22 2．1．7．5几丁质酶野生型和突变体热稳定性测定 ．23 2．1．7．6几丁质酶野生型和突变体pH耐受性测定 ．．23 2．1．7．7金属离子对几丁质酶野生型和突变体活性的影响 ．23 2．1．7．8几丁质酶野生型和突变体动力学常数测定 ．23 2．1．8 几丁质酶野生型和突变体蛋白结构模拟 ．23 2．1．9 几丁质酶突变体对秀丽隐杆线虫的毒性研究 24 2．1．9．1秀丽隐杆线虫培养 ．24 2．1．9．2几丁质酶突变体对秀丽隐杆线虫致死率的测定 ．24 2．1．9．3几丁质酶突变体对秀丽隐杆线虫繁殖的影响测定 ．24 2．1．9．4几丁质酶突变体对秀丽隐杆线虫幼虫生长的影响测定 ．24 2．2 结果与分析 25 2．2．1 pachi基因随机突变库的构建 ．．25 2．2．2 高活性突变株的筛选 ．27 2．2．3 野生型和突变体几丁质酶的纯化表达 ．27 2．2．4 野生型和突变体几丁质酶的酶学性质分析 ．30 2．2．5 几丁质酶突变体PachimsD对线虫毒杀、繁殖和生长抑制的影响 34 2．3 讨j沧 ．37 2．3．1 几丁质酶突变体酶学性质分析 ．37 2．3．2 几丁质酶突变体杀线虫活性分析 ．38 2．3．3 小结 39 II 万方数据 几丁质酶的活性改良及固定化研究3 几丁质酶的活性改良及固定化研究 3 几丁质酶PachimsD固定化研究及酶学性质分析 ．40 3．1 材料与方法 40 3．1．1 材料 40 3．1．2 方法 41 3．2 结果与分析 44 3．2．1 固定化酶Im PaehiN35D的酶学性质分析 ．．44 3．2．2 固定化酶Im PaehiN35D的固定化效率分析 ．．46 3．2．3 纳米Si02材料的傅里叶红外光谱分析 47 3．2．4 纳米Si02材料的扫描电镜分析 48 3．3 讨论 ．48 3．3．1 固定化酶固定化效率分析 ．48 3．3．2 固定化酶酶学性质分析 ．49 3．3．3 小结 50 参考文献 。5 1 研究成果 。58 致 谢 ．．59 万方数据 几丁质酶的活性改良及固定化研究摘 几丁质酶的活性改良及固定化研究 摘 要 几丁质酶是一类催化水解几丁质及其衍生物中的D．1，4糖苷键，产生Ⅳ-乙 酰胺基葡萄糖的糖基水解酶。几丁质被几丁质酶水解后，能产生多种不同聚合 度的几丁寡糖。这些几丁寡糖具有多种生物活性，比如抗细菌和真菌活性，调 控机体免疫能力及抗癌等功能。而且，几丁质酶能破坏植物寄生线虫肠道和病 原真菌细胞壁中的几丁质成分。因此，几丁质酶在医药领域、环保领域和农林 业中具有十分广泛的应用价值。 本研究是针对实验室先前克隆的几丁质酶基因pachi，通过易错PCR技术 构建pachi基因的随机突变库，采用96深孔板和T7噬菌体结合的高通量筛选 技术，以1％可溶性壳聚糖为底物，DNS为指示剂，对随机突变库进行筛选。 从大约12000个突变株中筛选到一株活性明显提高的突变体PachiN35D，与野生 型进行氨基酸序列比对发现，突变体的第35位氨基酸残基由原来的天冬酰胺替 换成天冬氨酸。比较分析野生型几丁质酶Pachi和突变体PaChiN35D的酶学性质 发现，对于可溶性壳聚糖底物，突变体PachiN35D的最适温度为50℃，比野生型 Pachi的60℃下降了10℃。野生型Pachi在60℃水浴1 h后，还能保持76％的 活性，而突变体PachiN35D在55℃水浴1 h后几乎完全丧失活性。分析野生型和 突变体的动力学常数，野生型Pachi的‰是36．1 mg／mL，突变体PachiN3SD的 ‰是13．3 mg／mL，突变体对于可溶性壳聚糖底物的亲和力提高了63％；野生型 的㈣值是0．37 mL／mg／min，而突变体的如编值是1．14 mL／mg／min，表明 突变体PachiN35D的催化效率比野生型Pachi提高了2．1倍，并且突变