原子力显微镜力谱研究大肠杆菌启动子与RNA聚合酶的-微生物学报.PDF

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2018, 58(1): 109-121 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Article 研究报告 原子力显微镜力谱研究大肠杆菌启动子与 RNA 聚合酶的相互 作用 姚智绚，张晓娟，段艳婷，张晓梅，史劲松，许正宏* 工业生物技术教育部重点实验室，粮食与发酵国家工程实验室，江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122 摘要：【目的】本研究通过原子力显微镜(AFM)力谱技术研究了大肠杆菌启动子与 RNA 聚合酶(RNAp) 间的相互作用，目的是建立一种高效的体外表征启动子的新方法。【方法】优化了用于单分子AFM 力 谱分析的蛋白固定化策略，建立 AFM 力谱分析启动子的策略，以缺失识别启动子序列的 σ 亚基核心 RNA 聚合酶(RNAp-C)为对照，研究启动子/RNAp 间相互作用的特异性。最后比较了序列较典型的 Ls1 启动子和缺失–10 区的 Ls2 启动子的力谱。【结果】基于建立的方法，验证了Ls1 与大肠杆菌 RNAp 结 合的特异性，其相互作用力为(331.10±5.10) pN。与 Ls1 相比，Ls2 启动子与 RNAp 结合显著减少。利 用启动子探针质粒，以报告基因 cat 的表达产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的酶活验证 Ls1 、Ls2 启动子强 度，分别为(181.70±4.10)、(0.30±0.20) U/mg。【结论】本研究建立的基于AFM 力谱技术的启动子分析 技术，是一种高效的、直接定量表征启动子活性的新方法。 关键词：作用力，大肠杆菌启动子，RNA 聚合酶，AFM ，CAT 酶活 启动子是一个重要的基因表达顺式调控元件 成为趋势。其中高效、精确、定量表征启动子活 (cis-acting element) ，在调控转录环节中占有十分 性的方法是一个重要的先决条件[2] 。 重要的地位。了解影响启动子的因素，明晰启动 目前启动子强度主要通过报告基因编码的 子启动转录的生物物理学机制，进而理性设计不 蛋 白 表 达 量 来 表 征 ， 如 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 同强度的精准启动子，具有重要的科学和工程意 (Chloramphenicol acetyl transferase ，CAT)[3] 、β-半 义。近年来，在代谢工程研究领域，通过改变启 乳糖苷酶[4]和荧光蛋白等[5] 。然而这种分析方法操 动子强度，精细调节代谢流量分配，成为工业微 作繁琐、周期长，易受到菌体生长阶段和生理状 生物领域较常用的代谢改造策略[1] 。因此以启动子 态的干扰，最终的表达量还受到其他多重元件的 为代表的代谢调控元件的标准化、模块化处理已 调控，并不能直接体现启动子的调控效果，并且 基金项目：江苏自然科学基金(B ；国家自然科学基金 *通信作者。Tel/Fax ：+86-510；E-mail ：zhenghxu@ 收稿日期：2017-01-29 ；修回日期：2017-04-11 ；网络出版日期：2017-04-18 110 Zhixuan Yao et al. | Acta Microbiologica Sinica , 2018, 58(1) 造成不同表达系统之间的启动子强度数据无法直 谱分析元件活性的研究目前仍相对缺乏。 接比较。加之受到检测方法的限制，导致定量分析 本研究中，首先建立了可用于 AFM 力谱分析 效率低，准确度不高，制约了启动子元件化、标准 启动子与 RNAp 交互作用的基底固定化策略，进 化的发展。此外，凝胶阻滞分析 (Electrophoresis