《SNT1151.1-2002-对虾Taura综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法》.pdfVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1151.1一 2002 对虾Taura综合征病毒(Tsv)逆转 录聚合酶链式反应 (RT-PCR)诊断方法 Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechain reaction(RT-PCR)fortuarasyndromevirus(TSV) 2002一11一25发布 2003一05一01实施 中 华 人 民 共 和 国 国家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 SN/T 1151.1-2002 目q 台 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘鱿、史秀杰。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1151.1-2002 对虾Taura综合征病毒(TSV) 逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)诊断方法 范 围 本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测对虾Taura综合征病毒的方法。 本标准适用于对虾Taura综合征病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件 其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 (eqvISO3696:1987) 3 试 剂和材料 3.1 水 应符合GB/T668Z-1992中一级水的规格。 3.2 Taq酶 -20℃保存 不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.3 逆转录酶AMV -20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.4 RNA抑制剂又RNasin) 一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.5 dNTP含《dCTP,dGTP,dATP,dTTP各 10mmol/L) 3.6 引物 浓度为40pmol/I。其序列如下: 上游引物TSVF:S-TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 下游引物 TSVR:5’一AAG丁AGACA GCCGCGCT丁一3 工 ， J 尹 异丙醇 分析纯，使用前预冷到一20C, Q 口 以 U 矿物油 要求无DNA酶和RNA酶。 q O J 户 剪刀、镊子 月 马 器材和设备 4.1 PCR扩增仪 4.2 电泳仪 4.3 微量移液器及吸头 4.4 紫外观察灯 4.5 恒温培养箱 4.6 普通冰箱和低温冰箱 SN/T 1151.1-2002 4.7 电动匀浆器 4.8 离心机和离心管 5 Taura综合征病毒核酸的鉴定 5 1 采样 取活虾，或取头部放在95%的酒精中(可以在常温下保存30d)，但样品处理前须让酒精完全挥发。 取约50mg-100mg的鳃丝(或者附肢、上皮、血淋巴)，放在 1.5mL的离心管中。 5.2 样品处理 应在10℃以下进行 先加人150pLCTAB(见附录A.1)溶液，用小剪刀剪碎后，用电搅拌器将样 品匀浆成糊状。再加CTAB溶液到900pL,混匀后于25℃作用2h 5.3 RNA抽提 在含有样品的离心管中加人600pL抽提液1(见附录A.2)，充分混匀30s,12000r/min离心 5min，取一层水相(约750pL)。再加人650pL抽提液2(见附录A.3)，充分混匀30s,12000r/min离 心5min，取上层水相(约600pL)