《SNT1151.4-2003-对虾黄头病毒(YHV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法》.pdfVIP

SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1151.4-2003 对虾黄头病毒(YHv)逆转录 聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法 Protocolofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR) foryellowheadvirusofshrimp(YHV) 2003-05-28发布 2003-12-01实施 中 华 人 民 共 和 国 发 布 国家质量监督检验检疫总 局 SN/T1151.4-2003 .岛 召. ..‘月 月q 青 本标准的附录A是规范性附录，附录s是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:刘左、史秀杰、高隆英、江育林。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T1151.4-2003 对虾黄头病毒(YHV)逆转录 聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法 1 范围 本标准规定了用逆转录聚合酶链式反应技术检测对虾黄头病毒的方法。 本标准适用于对虾黄头病毒的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987) 3 试荆和材料 3.1 水:应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。 3.2 Taq酶:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.3 逆转录酶AMV:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化. 3.4 核糖核酸酶抑制剂(RNasin):一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.5 dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各 10mmol/L), 3.6 引物:浓度为40kmol/L。其序列如下: 上游引物 10F:5-CCGCTAATTTCAAAAACTACG-3 下游引物 144R:5-AAGGTGTTATGTCGAGGAAGT-3 3.7 异丙醉:分析纯，使用前预冷到一200C, 3.8 矿物油:要求无DNA酶和RNA酶。 3.9 标准分子量:推荐使用pUC19DNA/MspIHpaII)，各片段大小依次为501bp,4046p,331bp, 2426p,1906p,147bpo 4 器材和设备 4.1 PCR扩增仪。 4.2 电泳仪。 4.3 微量移液器及吸头。 4.4 紫外观察灯。 4.5 恒温培养箱。 4.6 普通冰箱和低温冰箱。 4.7 电动匀浆器。 4.8 离心机和离心管。 4.9 制冰机。 取样和制样 5.1 取样 SN/T 1151.4-2003 5.1.1取新鲜的对虾组织作为祥品。处理前要将样品放在冰上。如果2h以后才能处理，宜将样品保 存在无水乙醇中，无水乙醇体积是样品体积的10倍以上，可放置在室温下保存4个月。血淋巴样品需 保存在一70r, 5.1.2 对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作样品。取虾头时，用灭菌剪刀和镊子去除眼睛、头胸甲、所 有的胸部附器和头部以后的腹部。 5.1.3 对于成虾，取鳃丝、淋巴器官或血淋巴作为样品. 5