《SNT1151.5-2003-对虾杆状病毒(BP)检测方法》.pdfVIP

S I 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1151.5-2003 对虾杆状病毒 (BP)检测方法 ProtocolofdetectionforBaculoviruspenaei 2003-05-28发布 2003-12-01实施 中 华 人 民 共 和 国 发 布 国家质 量 监督 检 验 检 疫 总 局 SN/T1151.5-2003 前 言 本标准是采用OIE的 水《生动物健康手册》2000年版的检疫规程。 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:江育林、陈莉莉、潘坤永、史秀杰。 SN/T1151.5-2003 对虾杆状病毒 (,BP)检测方法 范 围 本标准规定了用直接显微镜镜检和用聚合酶链式反应(PCR)技术检测对虾杆状病毒的方法。 本标准适用于对虾杆状病毒的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987) GB/T18088-200。 出人境动物检疫采样 SN/T1151.3-2002 斑节对虾杆状病毒(MBV)诊断方法 3 试 荆和材料 段 1 阳性病毒DNA:由OIE参考实验室提供或由国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。 乳 2 水:应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。 3 . 3 Taq酶:-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3 . 4 dNTP:含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各 10mmol/L, 3 . 5 引物:有二对引物可选用。使用时浓度为40Ismol/L。其序列如下: BPIF:5-GAT-CTG CAA-GAGGAC-AAA-CC-3 BPlR:5-ATC-GCT-AAGCTC-TGGCAT-CC-3’扩增目的基因中的560饰片段。 BP2F:5-TGT-TCT-CAG-CCA-ATA-CAT-CG 3 BP2R:5-ATC-CTGTTT-CCA-AGC-TCT-GC-3’扩增目的基因中的580by片段。 3.6 异丙醇:分析纯，使用前预冷到一20-C. 3 7 矿物油:要求无DNA酶和RNA酶。 3.8 DNA分子量标准(Marker), 3 9 样品缓冲液:按使用说明书中规定的比例与样品混合。 4 器材和设备 4.1 PCR扩增仪。 4.2 电泳仪。 4.3 微量移液器及吸头。 4.4 紫外观察灯。 4.5 恒温培养箱。 4.6 普通冰箱和低温冰箱。 4.7 电动匀浆器。 4.8 普通显微境。 4.9 离心机和离心管。 4.10 剪刀、镊子。 SN/T1151.5-2003 5 直接光学显徽镜检查 5.1 原理 取活的(鲜活的、濒死的或有损伤的)对虾的肝胰腺，或者用收集到的粪便样品做湿压片，观察BP 在肝胰腺中形成的有特征性的三角形包涵体. 52 新鲜组织湿片法 必须是活虾，取出肝胰腺。幼体在解剖镜下将肝胰腺摘出，置于载玻片上，小心地制备压片。用相 差或亮视野显微镜检查，在肝胰腺或中肠的湿压片中，如果观察到上皮细胞的核内有单个或多个四面体 的包涵体，就可以诊断为BP感染。包涵体呈四面体或金字塔形，从