茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析药用植物学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．1．10 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．1．10 PcPMK基因全长扩增 ．．17 2．1．1 1 PcPMK基因组DNA序列获得 ．．】8 2．1．12 PcPMK基因生物信息学分析 ．18 2．2结果与分析 ．19 2-2．1 PcPMK基因的分子克隆 一19 2．2．2 PcPMK基因结构与启动子分析 ．．21 2．2．3 PcPMK蛋白质系统发育分析 ．22 2．2．4 PcPMK蛋白质理化性质预测分析 ．25 2．2．5 PcPMK蛋白质3D结构模拟与功能分析 26 2．3小结与讨论 29 2．3．1小结 29 2．3．2讨论 29 3茯苓PcPMK基因的酵母功能互补 32 3．1材料与方法 ．33 3．1．1菌株和载体 33 3．1．2主要试剂 33 3．1．3主要仪器设备 ．33 3．1．4酵母表达载体的构建及酵母转化 ．33 3．1．5酵母产孢培养及四分体单孢分离 ．35 3．1．6尸c嗽基因功能互补展示 ．．36 3．2结果与分析 ．37 3．2．1酵母表达载体的构建 ．37 3．2_2酵母单倍体菌株分离 38 3．2．3 PcPMK基因酵母功能互补 ．．40 3．3小结与讨论 ．40 3．3．1小结 40 3．3．2讨论 41 4茯苓磷酸甲羟戊酸激酶体外酶活验证及酶动力学研究 ．．42 4．1材料与方法 43 4．1．1菌株和载体 ．．43 万方数据 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析4．1．2主要试剂、耗材 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析 4．1．2主要试剂、耗材 ．．43 4．1．3主要仪器设备 ．43 4．1．4原核表达载体的构建 ．．44 4．1．5 PcPMK蛋白表达及纯化 一45 4．1．6 PcPMK功能的体外酶促反应验证 ．．46 4．1。7 PcPMK的酶动力学研究 一47 4．2结果与分析 ．47 4．2．1 PcPMK蛋白表达与纯化 一47 4．2．2重组PcPMK的体外活性 ．49 4．2．3不同Mn2+和M92+浓度对PcPMK酶活力的影响 ．50 4．2．4 PcPMK酶动力常数 51 4．3小结与讨论 ．54 4．3．1小结 54 4．3．2讨{仑 ．．54 5结论和展望 ．57 5．1结j念 ．57 5．2展望 ．．57 5．3本文创新点 ．58 参考文献 ．59 附翥之 ． 68 附录1本研究中使用的引物序列列表 ．．68 附录2 PcPMK基因序列结构 ．．69 附录3本研究中所使用培养基、试剂配方 ．71 附录4 PcPMK蛋白表达与纯化优化过程SDS．PAGE ．．75 附录5攻读硕士学位期间主要学术成果 ．77 致 谢 ．78 万方数据 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析摘要 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析 摘要 茯苓是一种药食两用、大宗的常用中药材，是高等真菌茯苓Poria COCOS(Schw．) Wolf的干燥菌核，有茯苓与茯苓皮两味药材。三萜类化合物是其主要活性成分之一， 具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥等多种生物活性。茯苓通过甲羟戊酸途径(MVApathway) 合成萜类骨架，并进一步形成各种活性萜类物质。5．磷酸甲羟戊酸激酶 (phosphomevalonate kinase)是MVA途径的第5个酶，其能催化5一磷酸甲羟戊酸 (MvAP)形成5．焦磷酸甲羟戊酸的反应及其逆反应，是MVA到IPP途径中的限速 步骤；其基因表达量较低，且受下游产物的调节，是整个萜类合成途径中的重要调 节位点之一。本研究克隆出茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因(尸cPMK)，通过酵母功能互 补和体外酶促反应验证基因功能，并进行了相关酶动力学研究。主要研究结果如下： l成功克隆尸卯彪K基因 利用系列方法获得具有完整ORf的茯苓磷酸甲羟戊 酸激酶基因(PcPMK)mRNA序列1662bp，基因组DNA序列3249bp；基因具有6 个内含子、7个外显子，启动子区具有ABA、生长素、MYB等多种转录调控位点。 基因编码具有511个氨基酸，预测分子量54．8kDa的不稳定疏水性蛋白PcPMK。 PcPMK蛋白序列与真菌同源性较高，系统发育分析表明，蛋白的聚类结果与物种分 类地位一致。蛋白具有与活性相关的P—loop等3个保守功能域，且这些功能域在模 拟的PcPMK 3D结构上相邻，具有典型GHMP家族蛋白的特征。 2 PcPMK基因能互补酵母ERG8基因功能构建酵母表达载体pYES2．pcpmk， 转化至ERG8杂合突变型酿酒酵母菌株中。优化产孢条件后，菌株在McClary培养 基上25℃产孢培养15天，取细胞经30mg／mL蜗牛酶30℃酶解约60min后，进行四 分体单