肠道病毒71型vp1基因和5非编码区核酸序列分析流行病与卫生统计学专业论文.docx

1 1a 1 1a，a-‘ lUlll lUlll 1 Iilll I 11111 Ill III Y1 932226 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 日期：2011年乡月俘日 多玩彬 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 孙妈 日期：2011年f月／6日 !lp aa·m-E‘，酌，a·· 摘要摘要 摘要 摘要 肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引起儿童手足口病(Hand，foot and mouth disease，m?MD)暴发流行的主要病原体之一，它还能够引起无菌性 脑膜炎、神经源性肺水肿等与神经系统相关的疾病，致残及病死率较高。2008 年春夏之际，我国部分省区(市)出现了EV71引起的手足口病的严重疫情，重 症和死亡病例不断出现。2008年5月卫生部将手足口病纳入丙类传染病进行管 理。EV71是小RNA病毒科(Picomaviridae)、肠道病毒属(Enterovirus)的成 员，VPl是其主要的中和决定因子，能够直接决定其抗原性，具有与肠道病毒 血清型完全对应的遗传多样性。EV71的5’非编码区(Untranslated region，UTR) 含有一个I型的内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)和其 它结构，在病毒复制和翻译起始过程中发挥重要的作用，对脊髓灰质炎病毒的 研究发现5UTR涉及病毒毒力。 对不同临床背景的EV71毒株的VPl和5UTR核酸序列的测定和分析，有 助于阐明EV71的VPl和5UTR与致病性的关系；确定EV71毒株的型别对于 EV71的亚型的监测和防控策略的制定有较大的意义；目前有关EV71的研究中， IRES在EV71的5UTR区的定位和长度仍不明确，确定IRES在EV71的5UTR 区中的准确位置，可以为研究IRES的功能提供更加精确的位点。 目的 1．比较不同临床结局EV7l毒株VPl和5’u限的核酸序列。 2．确定研究中EV7l毒株的型别。 3．比较不同临床结局EV71毒株5UTR的RNA二级结构。 4．确定EV71内部核糖体进入位点(Ⅱ也S)5’及3’端分界。 方法 1．标本来源：粪便标本采集自2010年3月至5月间在郑州市第六人民医院 住院的手足口病患儿。 2．病毒核酸提取：提取标本处理液中的病毒RNA。 3．EV71的检测：用EV71特异性引物对提取的病毒KNA进行RT-PCR检测。 4．vPl和5UTR的逆转录PCR：挑选不同临床结局的EV71毒株的RNA， 分别用VPl和5UTR特异性引物对VPI和5UTR进行扩增。 I 摘要5．5UTR的克隆与鉴定：经过凝胶提取和纯化，将所得的5UTR片段与载 摘要 5．5UTR的克隆与鉴定：经过凝胶提取和纯化，将所得的5UTR片段与载 体进行连接，转化入感受态细胞中，筛选阳性克隆，增菌培养后提取质粒，以 5UTR特异性引物对提取的质粒进行PCR检测。 6．分析比较VPl和5UTR序列，构建系统进化树：将不同临床结局EV71 毒株VPI、5UTR测序后用MEGA5进行核酸序列的分析。用MEGA5构建系 统进化树。 7．5UTR的RNA二级结构预测：用RNAdraw 1．1来预测5UTR的RNA二 级结构。 结果 1．获得了EV7l VPl和5UTR完整的核苷酸序列。 2．研究中11个毒株的VPl核苷酸序列(891bp)间的一致率都在97．6％以 上，重症组和轻症组毒株间VPl序列的一致率在97．8％一100％之间。11个毒株 VPl氨基酸序列(297个氨基酸)问的一致率为100％。9个毒株的5UTR核苷酸 序列(743bp)间的一致率均在96．9％以上，重症组和轻症组毒株间5UTR序列 的一致率在96．9％-99．0％之间。 3．2010年郑州EV71毒株的VPl核酸序列与C4a亚型毒株的平均一致率为 97．4％，属于C4a亚型。根据5U