测定痕量痕量CytC及预测人体疾病.doc

PAGE PAGE 27 2009.8.20修改 Tween-80增敏富勒醇固体基质室温磷光法测定痕量 细胞色素C及人体疾病预报 摘 要 基于Tween-80能增敏富勒醇(Fullerol，简记F-ol)与细胞色素C (Cytochrome C，简记Cyt C)生成无磷光化合物的反应而导致F-ol的室温磷光(RTP)信号剧烈猝灭的学术思想，据此建立了Tween-80增敏F-ol固体基质室温磷光法 (SS-RTP)测定痕量Cyt C的新方法。该方法的检出限为12.0 zg spot－1，灵敏度高，且准确、简便、快捷和选择性好，且在0.040-9.6 ag spot－1范围内与ΔIp成线性关系，适用于人血清中Cyt C含量的测定与人体疾病预报，结果与ELISA相吻合。同时探讨了Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的反应机理。新的方法拓展了F-ol在生命科学的应用领域，为临床人体疾病预报提供了新的技术。 关键词：富勒醇; 细胞色素C; Tween-80; 固体基质室温磷光法 1. 前 言 Cyt C不仅是一种水溶性的含血红素类氧化还原蛋白质[1]，亦是线粒体释放的最重要的促凋亡因子之一，具有调节能量代谢和调节细胞凋亡的作用[2-3]。小儿白血病是小儿恶性肿瘤中发病率最高的疾病，严重地威胁着患者的生命安全。近年来的研究发现，白血病的发生和化疗药物对白血病细胞的杀伤作用都与细胞凋亡密切相关[4]。有关细胞色素C 的临床检测及其促凋亡活性调节分子机制和释放机制的研究已成为当前研究的热点[5]。 国内外有关细胞色素C的测定有分光光度法(LD: 1.3 × 10－3 g mL－1) [6]、荧光猝灭法 (LD: 12.4 g mL－1) [7]、同步荧光光谱法(线性范围为0.036-0.192 g L－1) [8 CdS 量子点共振瑞利散射光谱法(LD: 1.1 ×10－9 g mL－1) [9]、电化学探针伏安法(LD: 1.6 × 10－4 g mL－1) [10]、循环伏安法[11]、吸附法(LD: 5.0 × 10－3 g mL－1) [12]、ED/Au /I－ 复合修饰电极法(LD: 4.0 × 10－6 g mL－1) [13]、毛细管电泳法(Capillary zone electrophoretic method，CZE，LD: 7.43 ×10－13 g mL－1) [14]、电流测定法(Amperometric method, LD: 4.2 × 10－5 g mL－1) [15]、蛋白质印迹法(LD: 5.0 × 10－5 g mL－1) [16]、酶联免疫法 (ELISA, LD: 1.0 × 10－9 g mL－1) [17]等。上述方法除了灵敏度较低外，还存在以下缺陷：分光光度法选择性差，荧光猝灭法背景的干扰较大，同步荧光光谱法线性范围较窄，共振瑞利散射光谱法仪器昂贵，电化学分析法重现性较差，酶联免疫法非特异性干扰较大等。显然，这些方法难于满足生物试样中低含量 实验研究发现，在50℃、15 min和Pb2+离子微扰剂的条件下，F-ol、Cyt C均可发射微弱的RTP；当Tween-80存在时，F-ol的RTP信号剧烈增强，表明Tween-80可增强F-ol的RTP信号，同时λemmax蓝移了22.2 nm，提示体系中有胶束化合物生成；往体系中加入9.6 ag Cyt C时，F-ol的RTP信号剧烈猝灭，比无加Tween-80时ΔIp (12.7)增大9.4倍，据此可建立Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的新方法。该方法的检出限为12.0 zg spot－1 (对应浓度为3.0 × 10－17g mL－1)，灵敏度高，已成功用于人血清中Cyt C含量的测定，结果与ELISA相吻合。依据Cyt C含量与细胞凋亡的相关性，可预测人体疾病。鲜见Tween-80增敏F-ol SS-RTP测定痕量Cyt C的文献报道。本文基于F-ol的RTP特性及其与Cyt C的反应，提出了SS-RTP测定痕量Cyt C 2. 实验部分 2.1 仪器与试剂 LS-55型荧光分光光度计(Perkin Elmer公司)，仪器参数：Delay 0.1ms，Gate 2.0 ms，Cycle 20 ms，Flash Count 1，Ex Slit 10 nm，Em Slit 8 nm，Speed 1500 nm min－1；AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；pHS－3B酸度计；0.5μL平头微量注射器(Shanghai Medical Laser Instrument Plant (Shanghai, 200000, hina))。细胞色素C (Cyt C,