实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度;一、实验目的 1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法 2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 ;二、原理;主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm； 核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值 纯DNA： ;（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析;1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=εcl 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； ε为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度; 2．常用方法 （1）标准曲线法 　　　　　　　　　　　　　　　　　 标准曲线与样品的测定条件必须一致。;（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。; 微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量;Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 ; 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 ;总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）;基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。;考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 ;Coomassie Dye-Based 蛋白质定量;双缩脲法测定蛋白质* 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 双缩脲 ;三、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂;四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。 五、注意事项 1. 须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3. 比色杯的使用;微量表达法 10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg 10-6 microgram 微（克） ?g 10-9 nanogram 纳（克） ng 10-12 picogram 皮 （克） pg 10-15 femtogram 飞（克） fg 10-18 attogram 阿、渺（克） ag 10-24 zepto（仄普托） 沙（克） zg ppm: parts per million 1 ?g/ml 1ppm ppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppb ppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt;五、分光光度计的使用 仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长;