氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷.doc

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷 一、采样与样品预处理（同微生物生物量碳） 土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。 二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE） 1、方法原理 土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通过测定浸提液中磷的增加量，估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用钼锑抗比色法测定。 2、仪器及设备 培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；分光光度计 3、试剂 无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[?(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸 ?(H2SO4)=95~98% 0.5mol/L NaHCO3：42.0g NaHCO3(化学纯)溶于800mL水中，用0.5mol/L NaOH调节溶液的pH至8.5，用去离子水稀释至1L。溶液贮存于塑料瓶中。长时间放置，使用前必须检验pH值。 钼锑抗试剂：称取酒石酸锑钾0.5g，溶解于100mL水中，制成0.5%的溶液。另称取钼酸铵10g，溶于450mL水中，徐徐加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将0.5%的酒石酸锑钾溶液加入到钼酸铵溶液中，最后加水至1 临用前（当天），称取左旋抗坏血酸1.5克（Vc，三级），溶解于100mL钼锑贮备液中， 磷标准溶液：准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4(分析纯)0.4394g，溶解在400mL水中，加浓H2SO45mL（防止发霉），转入1L容量瓶中，定容，摇匀。此溶液为 吸取磷标准溶液5mL，稀释至100mL，即为5mg/L P标准溶液（不宜久存）。 250ug/mL KH2PO4：0.5492 g KH2PO4-定容至 500ml 水；0.10984 g定容至100 m 硫酸溶液（2.5 mol L-1）：量取70.0 ml分析纯浓硫酸，稀释至500 ml。 1mol L-1 NaOH：称取40 g分析纯氢氧化钠，溶于1 2,6 二硝基酚指示剂：称取0.2 g 4、操作步骤 4.1薰蒸 称取相当于5.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100 mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门，在25oC的黑暗条件下放置24 打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。 薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，用NaHCO3 溶液(见下一步骤，试剂2)浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周，4℃下放置1个月或在-15oC 4.2浸提 薰蒸结束后，将土壤全部转移到250 mL的震荡瓶中，加入80 mL0.5mol/L NaHCO3溶液，在振荡机上振荡浸提30min（25℃，185rev/min）,用无磷滤纸 薰蒸开始的同时，称取等量土壤3份，同上用0.5mol/L NaHCO3 80 mL溶液浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液立即测定或在-15oC下保存。 P回收率测定 另取等量土壤3份，加入0.5 mL 250ug/mL KH2PO4（50ugP/g土）， 同上加入80 mL 0.5mol/L NaHCO3溶液浸提，浸提液在室温下可以放置1周，4℃下放置1个月或在-15oC 4.3测定 吸取土壤浸提液25 mL（根据土壤含磷量进行调整）于50mL容量瓶中. 调解pH：加2,6-二硝基苯酚1-2滴，用3mo