芪合酶基因Fm.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（８）：４１４８ 芪合酶基因ＦｍＳＴＳ在何首乌毛状根中的过量 表达及ｄｓＲＮＡ干扰 １，２ １ 朱宽鹏 　赵树进 （１广州军区广州总医院　广州　５１００１０　２华南理工大学 生物科学与工程学院　广州　５１０６４０） 摘要　目的：建立一套探究植物基因功能的方法体系，验证由芪合酶基因保守序列通过 ＲＡＣＥ扩 增技术在何首乌中得到的基因ＦｍＳＴＳ的功能。方法：由含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动的ｇｆｐ基因的植 物转基因表达基础质粒ｐＢＩＮ３５ＳＧＦＰ构建过表达质粒ｐＢＩＮ３５ＳＳＴＳＧＦＰ（阳性）和双链ＲＮＡ干 扰重组质粒ｐＢＩＮ３５Ｓ正向反向ＧＦＰ（阴性），并同空白表达质粒ｐＢＩＮ３５ＳＧＦＰ（空白）均导入野 生型发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４中，转化何首乌外植体，诱导生成毛状根并培养，对毛状根进行高效 液相色谱分析以及实时荧光定量检测。结果：在过表达组、空白组和干扰组中毛状根中发根农杆 菌Ｒｉ质粒中的ｒｏｌＢ基因和外源基因ｇｆｐ均有表达，高效液相色谱法分析芪合物二苯乙烯苷含量 依次为４．６７ｍｇ／ｇ、２．１８ｍｇ／ｇ和０．６５ｍｇ／ｇ，在ｍＲＮＡ水平上测试荧光定量检测基因ＦｍＳＴＳ表达 量：ＲＮＡｉ组是空白组的１／４３３．５３，过表达组是空白组的２．４１倍。结论：结果表明过量表达与双 链ＲＮＡ干扰相结合在植物基因功能研究中有良好的应用，何首乌中芪合酶ＦｍＳＴＳ是二苯乙烯 苷主要的合成酶。 关键词　过量表达　ｄｓＲＮＡ　ＲＮＡ干扰　何首乌　毛状根　荧光定量ＰＣＲ　高效液相色谱法 中图分类号　Ｑ９４３ ［３］ 　　何首乌（ＦａｌｌｏｐｉａｍｕｌｔｉｆｌｏｒａＴｈｕｎｂ．）为蓼科多年生 ＧＱ４１１４３１） 。ＦｍＳＴＳ基因在大肠杆菌中顺利表达生 缠绕草本植物，被２０１０版药典收藏，作为一种著名的 成芪类化合物白藜芦醇，但何首乌中未能检测出白藜 大宗中药材，何首乌具有抗氧化抗衰老、抑菌消炎、补 ［４］ 芦醇 。为确定何首乌中芪合酶基因ＦｍＳＴＳ的功能， 肝养肾、降压抗癌、益精血、乌须发的功效，临床应用十 本实验采用研究植物基因功能较为成熟的过量表达与 ［１］ 分广泛 。何首乌含有丰富的芳香族聚酮类化合物， 双链 ＲＮＡ干扰技术相结合，在何首乌毛状根体系中研 如大黄素、大黄酚、大黄酸等瞆醌类物质及其药用指标 究ＦｍＳＴＳ基因的功能。 活性成分二苯乙烯苷（属于芪类化合物），它是何首乌 　　过量表达即增加基因拷贝数，使得该基因表达量 受到生物或非生物胁迫（如真菌感染、紫外照射等）时 增加的一种方法，本文采用直接在表达质粒中添加目 ［２］ 产生的一种植物抗毒素（植保素） 。 的基因。双链 ＲＮＡ介导的基因沉默（ＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｄ 　　关于何首乌中次生代谢途径的研究鲜见报道，前 ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）是一种由双链 ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄ 期实验根据芪类化合物合成关键酶基因的保守序列为 ＲＮＡｄｓＲＮＡ）信号引发同源ｍＲＮＡ降解的转录后基因 基础设计引物，结合ｃＤＮＡ末端快速扩增技术（ＲＡＣＥ） 沉默（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ），普遍存 获得该基因的两端序列，拼接后获得何首乌ＰＫＳ基因