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                                                   烟台大学生命科学学院 生物综合实验 [生物科学、生物技术专业]         目录 蛋白质的提取及分离纯化2  SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)－Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)测定蛋白质的 分子量 9  植物组织和细胞的离体培养和体细胞胚诱导技术 16  植物叶绿体及其 DNA 的制备与分析 23  叶绿体多肽差异性31  植物细胞的原位杂交技术 38  动物组织总 DNA 的提取及特定基因片段的PCR 扩增41  实验一 三疣梭子蟹总 DNA 的提取 41  实验二 蟹螯足肌肉总 DNA 质量的检测 46  实验三 PCR 技术与结果分析 50  增强型绿色荧光蛋白基因的原核克隆与表达 54  1 蛋白质的提取及分离纯化 本实验的目的在于学习蛋白质的盐析沉淀、分子筛层析、离子交换层析等生物化学 实验技术，实现系统、完整的蛋白质提取、分离、纯化的基本实验技术和技能的综合训 练。 本实验的内容主要两个部分：1)通过盐析沉淀和分离筛柱层析获得可用于分离纯化 的蛋白质提取液；2)用离子交换柱层析进行蛋白质提取液的分离纯化。每部分实验计划 16 课时完成，32 课时(4 天)完成全部实验内容。 一、实验技术原理 1. 蛋白质的盐析沉淀 盐析法的原理是：蛋白质在稀盐溶液中溶液度会随着盐浓度的升高而升高，也即盐 溶；但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出，即盐析。 盐浓度增高水化膜被破坏，蛋白质原有的表面电荷被中和。同时蛋白质分子间的疏水相 互作用增强，从而导致蛋白质分子聚集沉淀析出。 盐析时一般选择溶解度足够大的中性盐，如硫酸铵、氯化钠、硫酸钾。但硫酸铵有 独特的优点：溶解度大、对温度不敏感；25 度饱和溶解度 769g/L，4.1 mol/L ，0 度时饱 和溶解度 679 g/L，3.9 mol/L 。而且分级效果好，有稳定蛋白质结构的作用，价格低廉， 废液可以肥田。所以通常多用硫酸铵做蛋白盐析沉淀。 2. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析也叫分子筛层析、排阻层析。在所有层析技术中，凝胶过滤层析是一 种最简单、最温和的层析技术，它依据生物分子的体积差异进行分子的分离（如 Fig. 1 所示）。 2 Fig. 1 Princinple of Gel Filtration Fig.2 描述了凝胶过滤层析中常用的术语：柱床体积（Total column volume V ）、外 t 水体积（Void volume V ）、洗脱体积（Elution volume V ）。 o e 3. 蛋白质的离子交换柱层析 离子交换层析(ion exchange chromatography, IEC)是最常用的层析方法之一。它是以 离子交换剂为固定相，盐溶液为流动相的液相层析方法。离子交换剂是由基质、功能基 团和反离子构成。在水溶液中离子交换剂上的反离子可以与溶液中的带相同电荷的离子 或基团可逆交换，并且保持理化特性不变。 3 离子交换层析是依据生物大分子在特定 pH 下的净电荷差异进行分离的。 Fi